[发明专利]一种用于丝状藻体冻存的非渗透保护剂

说明书

技术领域

本发明属于丝状体藻种保存技术领域，特别是涉及一种用于丝状藻体冻存的非渗透保护剂。

背景技术

海洋藻类为人类提供了丰富多样的生物资源，拥有重要的经济价值，同时也是海洋生态系统维持平衡的重要因素。近年来，海洋藻类种质保存技术的研究日益受到重视。我们已建立了多个海洋藻类种质库，收集并保存了大量具有生产应用价值的海藻资源。目前藻类的保种方法有液体保存法，胶囊化低温法或超低温保藏法。在大型海藻的种质保存技术中，液体保存法将种质置于液体培养基中在低温弱光下培养，是一种适合海藻丝状体扩增培养且较为实用和常规的种质保存方法；而胶囊化低温保存法是将生物材料经褐藻酸钠包埋并脱水后低温保存的一种方法，陈昌生、庄琰等运用该技术成功保存了坛紫菜和宣藻丝状体，郭金耀等也应用该方法对条斑紫菜进行了保存研究。但上述方法在实际应用中存在诸多弊端，如液体保存法在长时间培养和多次接种下，容易被杂藻污染、造成遗传变异及种质退化。胶囊化低温法的操作虽然比较简单，但是要求胶球的含水量达到适合的水平才能保证冻存的丝状体具有较高的存活率，且大多数微藻在培养后期常会从胶珠中溢出，有的胶珠还会融解，导致保种失败。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于大型海藻丝状体冻存的非渗透保护剂，从而弥补现有技术的不足。

本发明首先提供红藻糖苷在制备丝状藻体冻存保护剂中的应用，其中红藻糖苷的化学结构式如下：

本发明另外还提供一种用于丝状藻体冻存的保护剂，是包含有非渗透保护剂红藻糖苷和渗透性保护剂，

作为实施例的优选，所述的渗透性保护剂为二甲基亚砜(DMSO)。

所述的红藻糖苷作为非渗透冻存保护剂的应用对象是所有大型藻类丝状藻体，如紫菜、红毛菜、宣藻等。

本发明再一个方面提供一种丝状藻体的冻存方法：将丝状藻体打碎成300‐1000μm长小段，用新鲜培养基配成丝状藻体密度为3‐5mg/ml；加入冻存保护剂，使最终的红藻糖苷的浓度为5‐15％，DMSO的终浓度浓度优选为10％，加入冻存管中，混匀后室温平衡；4℃放置后置于‐80℃过夜，再放入液氮保存。

本发明所使用的红藻糖苷来源于红藻，与丝状藻体的相容性好；并且其功能等同于其它糖类非渗透保护剂，但却不受微生物利用，因此不会引起如蔗糖或葡萄糖似的污染的现象，能够对冻存丝状藻体起到很好的保护作用。

附图说明

图1：红藻糖苷作为非渗透冻存剂对坛紫菜丝状体细胞存活率的影响图；

图2：红藻糖苷作为非渗透冻存剂对坛紫菜丝状体生长曲线的影响图；

图3：红藻糖苷作为非渗透冻存剂对坛紫菜丝状体光能转化效率的影响图；

图4：红藻糖苷作为非渗透冻存剂对坛紫菜丝状体藻蛋白含量的影响图。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明作进一步详细描述。本发明不仅局限于此。

实施例1

取100g红藻粉和400‐600ml纯度为65‐75％的乙醇，于65‐75％的水浴中搅拌提取5‐7小时，搅拌速度100‐200转，取出，过滤得到的溶液旋转蒸发浓缩去乙醇，剩下的溶液以等量的乙酸乙酯萃取三次，每次10‐30min。得到的水溶液分别上阴阳离子交换树脂，先经过阴离子交换树脂，流出的溶液再经过阳离子交换树脂，流出的溶液以5‐10％NaOH中和，得到的溶液冷冻干燥后，以70‐80℃热乙醇溶解，溶出部分旋转蒸发干燥得到红藻糖苷。

配置冻存母液，将红藻糖苷和DMSO分别加入到盐度为25～30‰的海水中，其中DMSO的浓度是20％，而红藻糖苷的终浓度分别为10、20和30％(g/ml)，0.22μm滤膜过滤灭菌后4℃保存。

选择海水作为冻存坛紫菜丝状体的培养基，取生长状态良好的坛紫菜丝状体，用搅拌器打碎至约600‐1000μm长的小段，用灭菌海水重悬丝状体，使其初始密度为6mg/mL，将藻液与冻存母液等量混合，加入2ml冻存管，使DMSO的浓度是10％，而红藻糖苷的终浓度分别为5、10和15％(g/ml)。移液枪吹打混匀后置于4℃放30min后置于‐80℃过夜，第二天直接投入液氮保存。

48h后，取出冻存管，以40℃水中快速解冻后，新鲜海水洗涤3次后用50mL锥形瓶复养。并对保存的藻种的理化性质进行检测。

保护剂对冻存坛紫菜丝状体生长曲线的影响

复养后，丝状体每隔两天测量一次湿重，记录数据绘制生长曲线。