[发明专利]一种联产丙酮酸和α-酮戊二酸的重组光滑球拟酵母

说明书

本发明公开了一种联产丙酮酸和α‑酮戊二酸的重组光滑球拟酵母，属于发酵工程技术领域。通过基因工程技术，将来源于酿酒酵母的CDC19整合到pY26‑TEF‑GPD表达载体上，构建酵母重组表达质粒pY26‑CDC19，并将其电转进受体菌TgU‑中获得一株高产丙酮酸的工程菌株TgU^‑(pY26‑CDC19)，相对于对照菌，总酸产量(丙酮酸和α‑酮戊二酸)、总酸转化率和总酸生产强度分别提高了112.2％、115.6％和155.6％，最重要的是重组菌TgU^‑(pY26‑CDC19)的α‑酮戊二酸产量从其改造之前的0g/L增加到了30.1g/L。

技术领域

本发明涉及一种联产丙酮酸和α-酮戊二酸的重组光滑球拟酵母，属于发酵工程技术领域。

背景技术

酮酸是分子中同时含有羧基和酮基的化合物。根据分子中羧基和酮基的相对位置可分为α、β-酮酸，它们是一类在生物体内拥有重要作用的有机酸，同时目前社会对其需求量也不断在增加，其广泛应用于日化，食品，医疗，农业等行业。其中α酮酸是羧基在α碳原子上的的酮酸，丙酮酸是最简单的α酮酸。丙酮酸作为生物代谢的中间产物，处于各代谢途径的中间环节，是糖酵解的终产物；通过脱氢脱羧反应转化为TCA循环的起始物质乙酰-CoA；在丙酮酸羧化酶作用下生成TCA循环的中间产物草酰乙酸；通过转氨基作用生成丙氨酸等。同样，α-酮戊二酸作为例外一种重要的酮酸，是细胞内氮代谢的主要调控者。α-酮戊二酸作为谷氨酸的前体，与脯氨酸、精氨酸、鸟氨酸、多巴胺的分泌紧密相关，能有效维持胞内的“谷氨酸池”(glutamine pools)，并在中间代谢过程中决定着氮代谢流走向合成或者分解，有效的维持体内氮代谢平衡。α-酮戊二酸还与蛋白质、脂类、维生素合成以及能量代谢紧密相关。

目前对其上述两种重要的酮酸的生产主要是化学合成法和微生物发酵法两大类。其中微生物发酵法相对于其化学合成有更多的优点，如原料的转化率高、污染小、成本低等优点。但其两种酮酸的微生物发酵采用的是独立的发酵操作。由于微生物合成目标产物时，不可避免的存在副产物的积累，而两种酮酸在生物体的转化是极其容易，因而其单独发酵生产其中的某一种酮酸时，不可避免的要消除例外一种酮酸的存在，但是消除副产物的努力通常会显著降低转化率和生产强度，从而影响整个发酵过程的经济性。

如何将其两种酮酸在一种微生物中进行联产发酵，将对整个酮酸工业的发展有这重要的作用。联产发酵技术作为一种高效、经济的发酵技术成为了国内外研究的热门。通过微生物联产发酵获得高产丙酮酸和α-酮戊二酸，其最关键是要有一株高产丙酮酸和α-酮戊二酸的菌株。目前其两种酮酸的联产发酵鲜有文献报道。

发明内容

为了解决上述问题，本发明通过在高产丙酮酸的光滑球拟酵母菌株中过量表达丙酮酸激酶，加强丙酮酸和α-酮戊二酸合成的共同合成途径，从而对其两种酮酸进行高效率联产发酵。

本发明的第一个目的是提供一种联产丙酮酸和α-酮戊二酸的重组菌，所述重组菌是以光滑球拟酵母为宿主，以pY26-TEF-GPD为载体，过表达丙酮酸激酶CDC19基因。

在本发明的一种实施方式中，所述CDC19基因是NCBI上Gene ID为851193的CDC19基因。

在本发明的一种实施方式中，所述重组菌是以缺失了URA3基因的光滑球拟酵母T.glabrata CCTCC M202019为宿主，表达NCBI上Gene ID:851193的CDC19。

在本发明的一种实施方式中，所述CDC19基因是以酿酒酵母菌株S288c基因组为模板扩增得到的。

本发明的第二个目的是提供所述重组菌的构建方法，是以缺失了URA3基因的光滑球拟酵母T.glabrata CCTCC M202019为宿主，以pY26-TEF-GPD为载体，表达NCBI上Gene ID为851193的CDC19基因。

在本发明的一种实施方式中，所述重组菌按如下方法构建：