[发明专利]一种血清4型禽腺病毒灭活苗及其制备方法

说明书

技术领域

本发明属于疫苗制备技术领域，具体涉及一种基于悬浮培养技术的血清4型禽腺病毒灭活苗。

背景技术

禽腺病毒(Fowl Adenovirus，FAdV)属于腺病毒科禽腺病毒属，分为5个种(A-E)，12个血清型。虽然在世界各地均有报道，FAdV感染一般引起亚临床状况，而急性感染主要引起包涵体肝炎、心包积液以及肌胃糜烂等。自2013年，国内鸡群由FAdV引起的包涵体肝炎、心包积液病例逐渐增多。到2015年，FAdV感染在国内多个省份鸡群爆发。目前FAdV爆发不仅发生在3-4周龄肉鸡，还发生于10-20周龄的蛋鸡，给国内养鸡业造成了严重经济损失。病毒分离鉴定发现，目前高致病性血清4型FAdV在国内鸡群流行较广泛。然目前尚无针对血清4型FAdV的商品化疫苗。在疫苗的研制中，病毒效价的高低不仅影响免疫效果，而且直接影响疫苗成本及价格。病毒的鸡胚接种是禽用病毒疫苗常用的扩增技术。虽然血清4型FAdV病毒能在鸡胚中生长复制，但是鸡胚中扩增的血清4型FAdV病毒滴度较低，不能满足疫苗生产高效价的要求。另外，血清4型FAdV病毒虽然能在鸡肝细胞中有效复制，但是普通细胞培养也很难满足疫苗的规模化生产要求。病毒的悬浮培养技术可大大提高病毒效价，是高效价病毒疫苗规模化生产的发展趋势。

发明内容

本发明的目的是在于提供一基于悬浮培养技术的血清4型禽腺病毒灭活苗。本发明的原理和最核心的关键技术是利用鸡肝细胞，通过激流式生物反应器悬浮培养技术高效扩增血清4型禽腺病毒，并研制出高效价血清4型禽腺病毒灭活苗。

一种基于悬浮培养技术的血清4型禽腺病毒灭活苗，所述的灭活苗的抗原为通过悬浮培养方法获得的效价不低于10⁹TCID₅₀/ml的灭活后的血清4型禽腺病毒。

所述的灭活苗的抗原通过下述方法获得：将血清4型禽腺病毒接种于鸡肝细胞，利用激流式生物反应器扩增血清4型禽腺病毒；反应器转速为40r/min、200g载体初始细胞接种为1×109个、细胞生长液为10％FBS血清的DMEM/F12培养液、病毒感染及维持液为含2％FBS血清的DMEM/F12培养基、最适PH为7.0-7.2、病毒接种量MOI为0.1以及病毒收获时间为接种后96小时。

本发明还公开了一种制备高效价血清4型禽腺病毒灭活苗的方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)血清4型禽腺病毒悬浮培养：将血清4型禽腺病毒接种于鸡肝细胞，利用激流式生物反应器扩增血清4型禽腺病毒；悬浮培养激流式生物反应器主要培养条件参数为：反应器转速为40r/min、200g载体初始细胞接种为1×10⁹个、细胞培养液为10％FBS血清的DMEM/F12培养液、病毒感染及维持液为含2％FBS血清的DMEM/F12培养基、最适PH为7.0-7.2、病毒接种量MOI为0.1以及病毒收获时间为接种后96小时；感染后96小时后收集病毒、分装，并测定病毒效价；

(2)血清4型禽腺病毒灭活苗制备：将以上扩增获得的血清4型禽腺病毒按终浓度0.1％的比例加入甲醛溶液，置37℃灭活24小时，并进行灭活及无菌检验；将灭活血清4型禽腺病毒稀释至4×10^7.0TCID₅₀/mL，按V/V为4％的比例，向灭活病毒液中加入灭菌吐温-80，并使吐温-80彻底溶解，获得水相；将3份油相导入乳化罐中，同时缓慢加入1份水相进行乳化，制成血清4型禽腺病毒灭活疫苗，分装。

血清4型禽腺病毒灭活苗免疫保护效果评价：将以上制备的灭活疫苗采用皮下接种方式免疫21日龄SPF鸡，并设立未免疫鸡；在免疫后21天采血分离血清，测定中和抗体水平。免疫后21天，通过胸部肌肉接种方式对免疫鸡进行100个LD50病毒量进行攻毒试验。攻毒后连续观察14日，统计免疫保护率。非免疫对照组鸡为100％死亡，观察期内发病鸡多表现精神沉郁、羽毛粗乱、食欲不振，剖检可见心包积液、肝脏病变等相关组织病变；免疫组鸡为100％保护，观察期内未见任何异常现象，剖检未见腺病毒相关组织病变。

本发明的有益效果体现在：通过悬浮培养技术，研制出高效价血清4型禽腺病毒灭活苗，该疫苗效价可达10⁹TCID₅₀/ml，是传统鸡胚疫苗效价的100倍。高效价血清4型禽腺病毒灭活苗的制备可大大降低疫苗的成本，提供疫苗免疫效果，具有很好的应用前景。

附图说明

图1：PCR扩增血清4型禽腺病毒特异性DNA片段