[发明专利]TNF-α及其突变蛋白和载体蛋白DTT不同连接方式的疫苗制备方法

说明书

本发明提供了一种TNF‑α和载体蛋白DTT的不同的组合方式，包括不同的位置和3种连接分子的组合。通过位置的变化中的空间位阻作用这种形式的优化最终筛选出可以进一步降低TNF‑α生物学活性的组合方式，并且不影响整个疫苗的免疫原性。

技术领域

本发明属于生物和医药领域，TNF-α及其突变蛋白和载体蛋白DTT的不同的位置组合和连接方式的疫苗制备方法和用途。本发明通过不同的组合方式有效的筛选出高免疫原性的低TNF-α生物活性的候选疫苗。

背景技术

肿瘤坏死因子-α（TNF-α）是一种主要由单核细胞或巨噬细胞产生的细胞因子，不仅能选择性地杀伤某些肿瘤细胞，而且有多种免疫调节功能[Front Immunol. 2015, 364(6):2-4.]。肿瘤坏死因子作为一种重要的免疫调控分子在细胞的生长、分化以及死亡等生理和病理过程中发挥重要的作用。多种人类疾病和体内TNF-α的表达水平高有关，例如阿尔茨海默氏症、重度抑郁、肿瘤，以及类风湿性关节炎（rheumatoid arthritis, RA）[Arthritis Res Ther, 2005, 7(6): R1227-R1234.]、炎症性肠病（inflammatory boweldisease, IBD）[J Dig Dis, 2009, 10(1): 1-6.]、银屑病（psoriasis, Ps）[MediatorsInflamm, 2005, 2005(5): 273~275.] 等自身免疫性疾病。

TNF-α生物抑制剂包括单克隆抗体，可以阻断TNF-α发挥生物学活性和/或降低其机体水平，能有效治疗多种自身免疫性疾病 [International Immunology. 2015. 27(1):55~58.]，但使用频繁，费用昂贵，在中国只有不到10%的患者能够长期使用。因此，研发的多种以TNF-α为靶点的主动免疫制剂已经进展到不同的阶段治疗在mTNF-α分子中引入非天然的硝基酪氨酸[Proc Natl Acad Sci U S A. 2008, 105(32):11276-11280.]，引入外源的Th表位，都突破了小鼠的免疫耐受，产生的治疗性TNF-α中和抗体 [Nature. 1999. 17:666-669.]，但这两种策略没有克服抗原TNF-α生物学活性在免疫时引起的副作用。2006年Le Buanec等将hTNF-α通过戊二醛化学偶联到钥孔血蓝蛋白（keyhole limpet emocyanin,KLH）上，在小鼠模型上产生了中和hTNF-α的抗体，在小鼠关节炎模型上表现出明星的治疗效果[Proc Natl Acad Sci U S A. 2006. 103(32):19442-19447. ]，已经进展到II期临床研究。为了降低hTNF-α生物学活性在疫苗免疫时产生的副作用，需要通过甲醛处理数天对疫苗抗原的进行变性降低hTNF-α生物学活性，从而使疫苗成份更加复杂，增加了成药的不确定性。

因此，要发展安全有效的靶向TNF-α的疫苗，需要既降低疫苗抗原TNF-α生物学活性引起的副作用，又保留TNF-α中和免疫原性。可以通过两种方法实现，一种是

基于两个原因TNF-α细胞因子的生物学活性必须被中和。首先，TNF-α在其内源性状态下驱动炎症和器官改变，第二，在TNF-α过量产生条件的情况下在体内不应该认为疫苗是TNF-α的额外来源。本发明在通过将hTNF-α的生物学活性通过点突变的方式下降之后，再将载体蛋白DTT和突变TNF-α蛋白的连接方式依照不同顺序，不同连接分子的连接方式近一步降低TNF-α的生物学活性和不改变TNF-α本身的免疫原性。

发明内容

本发明的目的就是提供一种肿瘤坏死因子TNF-α和载体蛋白DTT以融合表达的方式的组合疫苗。

在本发明的第一方面，提供一种TNF-α及其突变蛋白和DTT的组合物，所述突变蛋白的生物活性低于野生型TNF-α蛋白，并且所述突变蛋白具有至少一个不同于野生型TNF-α的氨基酸突变位点，并且在所述野生型TNF-α蛋白的天然序列上通过拼接、替换、缺失、和/或插入而获得的与天然序列不同的突变蛋白。