[发明专利]一种胞外醛糖酸内酯酶PoALAC及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种胞外醛糖酸内酯酶，尤其涉及一种胞外醛糖酸内酯酶PoALAC及其应用，属于基因工程领域。

背景技术

木质纤维素生物质是世界上最丰富的可再生资源，可用于生产生物乙醇燃料和其它增值产品。纤维素的降解需要内切葡聚糖酶纤维二糖水解酶协同作用，使其转化成纤维二糖，再由β-葡萄糖苷酶将纤维二糖水解成葡萄糖。近年来，人们发现一种裂解性多糖单加氧酶(LPMOs)，能够通过氧化的方式断开纤维素链，从而和其它纤维素水解酶一起协同降解木质纤维素。研究表明，多糖单加氧酶的水解产物包括纤维寡糖、醛糖酸内酯和醛糖酸。而众所周知，醛糖酸内酯对多种糖苷水解酶都有抑制作用，比如β-葡萄糖苷酶受到葡萄糖酸内酯的强烈抑制。多糖单加氧酶能够和β-葡萄糖苷酶协同作用促进纤维素的降解，但是其产物醛糖酸内酯又对β-葡萄糖苷酶有抑制作用。在纤维素酶降解木质纤维素的体系中，能够产生内酯的不止限于多糖单加氧酶，还有纤维二糖脱氢酶和其它氧化还原酶类；受内酯抑制的酶类，不止限于β-葡萄糖苷酶，还有其它多种糖苷水解酶类。

经检索，有关胞外醛糖酸内酯酶PoALAC及其应用还未见报道。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种胞外醛糖酸内酯酶PoALAC及其应用。

本发明所述的胞外醛糖酸内酯酶PoALAC，其特征在于：该胞外醛糖酸内酯酶PoALAC的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

具体的，所述胞外醛糖酸内酯酶PoALAC包括419个氨基酸，N-端19个氨基酸为信号肽，成熟的PoALAC的理论分子量为43.1kDa。进一步的，本发明所述的胞外醛糖酸内酯酶PoALAC还涵盖在：所使用的蛋白为表现出醛糖酸内酯酶活性的PoALAC的变体，包括对该蛋白少量氨基酸的修改、插入或删除；以及所使用的蛋白为表现出醛糖酸内酯酶活性的与PoALAC序列一致度在50％及以上的醛糖酸内酯酶。

本发明还公开了一种包含上述醛糖酸内酯酶基因poalac的重组载体pPIC-poalac。

本发明还公开了一种包含上述重组载体pPIC-poalac的重组毕赤酵母工程菌株GS115/poalac。

本发明所述的胞外醛糖酸内酯酶PoALAC是由重组毕赤酵母工程菌株GS115/poalac发酵培养诱导表达、纯化回收获得。

用William公开的(Applied and Environmental Microbiology.2011,77:650-656)测量醛糖酸内酯酶活性的方法测定纯化的PoALAC比酶活是173009IU/mg。

本发明所述胞外醛糖酸内酯酶PoALAC在与多糖单加氧酶和β-葡萄糖苷酶协同降解磷酸膨胀纤维素中的应用

具体的，本发明提供了胞外醛糖酸内酯酶PoALAC在与多糖单加氧酶PoLPMO1和β-葡萄糖苷酶PoBGL1的在协同水解磷酸膨胀纤维素中的应用。

PoBGL1单独不能降解磷酸膨胀纤维素，PoLPMO1和PoBGL1协同作用可以降解磷酸膨胀纤维素产生葡萄糖。PoALAC、PoLPMO1和PoBGL1三者协同作用与PoLPMO1和PoBGL1二者协同作用相比，内酯浓度降低、β-葡萄糖苷酶比酶活升高、产生的葡萄糖浓度升高。说明PoALAC、PoLPMO1和PoBGL1三者协同作用，能进一步提高磷酸膨胀纤维素的降解效果。

本发明所述胞外醛糖酸内酯酶PoALAC在降解木质纤维素中的应用。

具体的，本发明提供了胞外醛糖酸内酯酶PoALAC与多糖单加氧酶PoLPMO1和β-葡萄糖苷酶PoBGL1协同作用促进多种木质纤维素降解的应用。

实验证实：无论是水解微晶纤维素还是不同方法预处理的天然底物，向来源于草酸青霉的混合纤维素酶SP或来源于里氏木霉的混合纤维素酶ST2中分别添加PoALAC、PoLPMO1和PoBGL1都能提高水解效果；添加量减半后两种酶同时添加，比单独添加效果要好，说明PoLPMO1和PoBGL1，PoALAC和PoLPMO1，PoALAC和PoBGL1两者间有协同作用；添加量减少三分之二后三种酶同时添加，比两两添加效果更好，说明PoALAC、PoLPMO1和PoBGL1三者间有强烈的协同作用。