[发明专利]一种花生转录因子AhJ11-FAR1-5基因的克隆及功能表达方法

说明书

本发明涉及生物基因工程领域，具体地说是花生转录因子AhJ11‑FAR1‑5基因的克隆及功能表达方法。本发明通过材料的准备与处理、RNA的提取和cDNA的合成、RACE克隆技术，合成出了AhJ11‑FAR1‑5。本发明还通过使用荧光定量RT‑PCR对AhJ11‑FAR1‑5基因干旱胁迫下的表达进行分析，并最终得出AhJ11‑FAR1‑5基因在花生对干旱胁迫的适应性中发挥重要作用。本发明将该基因通过转基因手段导入花生中，转基因植株比对照组具有明显的抗旱特性，说明AhJ11‑FAR1‑5基因能显著提高花生抗旱性。

【技术领域】

本发明涉及生物基因工程领域，具体地说是一种花生转录因子 AhJ11-FAR1-5基因的克隆及功能表达方法。

【背景技术】

我国是世界花生生产大国，种植面积居世界第二位，而总产量占世界花生总产量的40％以上，居世界第一位。但是，花生产业的进一步发展受到旱灾的威胁。据统计，我国每年因干旱引起的花生减产达30％～50％。除产量下降外，干旱还有可能导致花生黄曲霉毒素污染、品质下降等一系列后果。此外，随着干旱气候出现频率的增加，如果在逆境胁迫下保持甚至增加花生的产量，成为科学研究的一个方向。

随着科技的发展，利用转基因技术提高植物胁迫耐受能力的研究取得了巨大进步。当胁迫信号产生后，花生会启动一系列相应信号，最后传导到相关基因，启动该基因表达以协助花生适应或抵御逆境。转录因子是调控这些基因表达的重要因素。转录因子是指能够与真核基因启动子区域中顺式作用元件发生特异性作用的DNA结合蛋白，通过它们之间以及与其它相关蛋白之间的相互作用，调控基因的表达。

FARl作为phyA信号通路的正调控因子，1999年通过图位克隆得到(Hudson eta1.1999)。在随后的研究中发现，该转录因子含有一个与玉米Mutator家族的转座酶MuRA(Hudsonet a1.2003)以及转座酶Jittery相似的序列(Lisch，2002； Xu et al.2004)。作为一个起源进化于转座子的基因新家族，FARl能够稳定地存在于拟南芥基因组中，且没有检测到显著的末端反向重复序列(TIR)和其他的转座子类似结构(Hudsonet a1.2003)。FARl和Mutator类似的转座子拥有相似的结构，包括N端C2H2锌指结构域，中部推测的转座子核心结构域以及C端SWIM 锌指结构域。其中N端C2H2结构域具有DNA结合活性，C端结构域具有转录激活活性。基于这种进化过程，FARl成为了一种新型的转录因子，能够特异的识别FBS(FHY3-binding motif，CACGCGC)顺式作用元件(Linet a1.2007)，因此能够与启动子上含有FBS序列的基因特异性结合，调控它们的表达，行使生物学功能。到目前为止，花生中FARl基因的研究报道较少，关于其功能的研究报道更少。

【发明内容】

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种花生转录因子 AhJ11-FAR1-5基因的克隆及功能表达方法，显著提高花生的抗干旱能力。

本发明提供了一种花生转录因子AhJ11-FAR1-5基因的克隆方法，主要包括以下步骤：

(a)材料的准备与处理，其包括花生种子的萌发、生长以及干旱胁迫处理。具体步骤如下：材料选择花生品种J11，花生种子在Hoagland培养液培养萌发，萌发及幼苗生长条件为14h光照/10h黑暗，温度为26-28℃，生长12天用于后续的干旱胁迫处理；

干旱胁迫用PEG6000处理，花生根浸泡在15％PEG6000溶液中，在处理 0h、6h、12h、18h、24h、36h和48h时取花生的根作为材料，所有材料均保存于-80℃超低温冰箱中备用。

(b)花生幼苗的RNA的提取和cDNA的合成