[发明专利]一种获取转基因牛胎儿成纤维细胞的方法

权利要求书

1.一种NRAMP1巨噬细胞特异性表达打靶载体，其特征在于：该打靶载体包括目的基因NRAMP1以及用于将NRAMP1基因通过同源重组定点插入牛25号染色体FSCN1和ACTB基因间的元件序列；所述元件序列包括用于打靶位点同源重组的同源臂序列，同源臂以牛基因组为模板扩增，扩增产物分别为牛25号染色体上打靶位点的上游序列777bp作为左侧同源臂和下游序列816bp作为右侧同源臂；

所述左侧同源臂引物序列为：

LA-19T-F：5'-GCGGCCGCGTCTGACCCGTGAGTGTT-3'；SEQ.ID.NO：36；

LA-19T-R：5'-GTCGACGCGGCTAGTTTGGGAGTG-3'；SEQ.ID.NO：37；

所述右侧同源臂引物序列为：

RA-19T-F：5'-ATCGATACACCCTTTCTAGTGGTCC-3'；SEQ.ID.NO：38；

RA-19T-R：5'-AAGCTTTCCCGCTGATTGTTCTTC-3'；SEQ.ID.NO：39；

打靶位点位于牛25号染色体FSCN1和ACTB基因间，为SEQ.ID.NO：1序列内的394bp-413bp；所述元件序列还包括筛选标记eGFP基因和PURO基因，以及位于所述筛选标记基因两侧的两个同向LoxP序列；所述筛选标记eGFP基因和PURO基因都由EF1α启动子启动转录，并由自剪切肽P2A序列串联融合表达。

2.根据权利要求1所述一种NRAMP1巨噬细胞特异性表达打靶载体，其特征在于：所述目的基因NRAMP1是由外源扩增的NRAMP1基因自身启动子启动转录的。

3.一种插入目的基因NRAMP1的牛胎儿成纤维细胞的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：以牛胎儿成纤维细胞为宿主细胞，通过共转染打靶载体pNRAMP1-eGFP-P2A-Puro和针对打靶位点的单一CRISPR/Cas9切口酶表达载体，将目的基因NRAMP1定点整合到牛胎儿成纤维细胞的25号染色体FSCN1和ACTB基因间；所述单一CRISPR/Cas9切口酶表达载体包含有与打靶位点相对应的向导序列，打靶位点位于牛25号染色体FSCN1和ACTB基因间，为SEQ.ID.NO：1序列内的394bp-413bp。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述宿主细胞为传代2～3代的荷斯坦奶牛胎儿成纤维细胞。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述共转染操作采用电穿孔法。

6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述插入目的基因NRAMP1的牛胎儿成纤维细胞能在生产转基因克隆牛的核移植操作中作为供体细胞使用。