[发明专利]一种富含AT或者GC基因的合成方法

说明书

本发明公开了一种富含AT或者GC基因的合成方法。该方法包括：1)将基因的两条链分别分割成多个寡核苷酸片段，一条链寡核苷酸片段和对应的另外一条链寡核苷酸片段能够互补配对产生带有粘性末端的双链寡核苷酸片段；相邻两个双链寡核苷酸片段的相邻粘性末端能互补配对，且粘性末端长度依照基因的序列顺序，依次为4，6，…2(n+1)个碱基；2)合成寡核苷酸片段；3)将寡核苷酸链分段慢退火形成双链寡核苷酸片段；4)双链寡核苷酸片段磷酸化；5)将各双链寡核苷酸片段连接成完整的基因。该方法实现了富含AT或者GC基因的有效组装。

技术领域

本发明涉及生物工程领域，具体涉及一种富含AT或者GC基因的合成方法。

技术背景

随着医学工程，生物工程以及合成生物学的发展，根据天然存在的DNA序列或者人为创造的DNA序列，特异地进行体外DNA合成(基因合成)的需求越来越大。体外基因合成能够根据蛋白质的密码子特点，实现基因最优化的密码子组合，从而实现蛋白质的高效表达。它也能够根据研发的需要，实现多基因融合以及基因与多个调控区的有效融合。近来，体外基因合成还被用来创造以DNA为基本材质的新型纳米材料。

目前被工业界广泛采用的是基于聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)技术的DNA合成方法。这种合成方法是首先手动或者利用软件将一条基因的分割成若干个短的单链寡核苷酸片段。其中一部分单链寡核苷酸片段位于基因的正义链，一部分单链寡核苷酸片段位于基因的反义链；位于正义链和反义链上的单链寡核苷酸片段之间通过一定长度的互补配对重叠区，以搭桥的方式覆盖整条完整的基因长度。然后，利用修饰的碱基作为原料，使用包括固相合成法，磷酸二酯法，磷酸三酯法，亚磷酸三酯法，芯片合成法等化学合成的技术路线，合成这些单链寡核苷酸片段(需要指出的是这种单链DNA寡核苷酸片段的合成，长度越长，错误率越高。目前的行业内的单链DNA寡核苷酸合成技术而言，在100bp以下，保真度较好。因此目前，在各种具体的基因合成方法中，在化学法合成的阶段，通常长度控制在100bp以内)。接下来，搭桥的正义链和反义链的寡核苷酸片段之间互为模板，利用PCR技术进行一轮或多轮扩增，获得大量的完整的基因DNA。这些DNA最后，通过酶切，酶连或其它的分子克隆手段装载到质粒载体上，转化到大肠杆菌中，进行测序验证以及进一步的大量扩增。一些具体的方法虽然在PCR程序或者一些引物设计上有差别，但是基本上涵盖了上述核心流程(参考文献包括：Stemmer et al.,1995；Kodumalet al.,2004；Reisinger et al.,2006；Xiong et al.,2004和Xiong et al.,2006等)。

基于PCR技术的基因合成方法能够有效的合成GC含量在40％-60％的基因，然而对于一些富含AT(低GC)或者高GC的基因，合成能力有限。GC越低或者GC约高，合成越困难。对于AT含量在80％以上或者GC含量在70％以上，PCR技术几乎无法实现有效的合成。通常来说，利用PCR进行合成富含GC，常常因为寡核苷酸链或者局部DNA产物之间容易形成GC发夹，而造成合成失败。相反地，在利用PCR合成富含AT基因的时候，常常因为形成稳定的DNA双链困难，导致合成失败。另外，富含GC和AT基因常常也会伴随着高重复，这种高重复会导致合成的基因产生缺失或者插入，而导致合成失败。