[发明专利]一种非病毒iPSCs诱导组合物及其试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种非病毒iPSCs诱导组合物及其试剂盒，属于生物工程技术及再生医学领域。

背景技术

经典干细胞生物学通常认为细胞分化是单向不可逆的，1962年，英国科学家John B.Gurdon将青蛙肠细胞核移植入去核的青蛙卵细胞内，并发育成一只正常的蝌蚪，首次证实了体细胞核可以重编程为具有类似胚胎发育早期阶段的多能细胞状态，类似的技术也催生了各种克隆的哺乳动物诞生。在Gurdon成果报道四十年后，日本科学家Shinya Yamanaka于2006年利用逆转录病毒携带的四个转录因子(OCT4(标准基因名为：POU5F1)、SOX2、KLF4、c-MYC，简称OSKM)成功地将小鼠成纤维细胞重编程为具备胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESCs)多能性的诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)，次年Yamanaka研究小组利用相同的方法获得了人的iPSCs，与此同时James A.Thomson研究小组也通过慢病毒携带另外四个转录因子(OCT4、SOX2、Nanog、Lin28，简称OSNL)成功获得了人的iPSCs(hiPSCs)。由于iPSCs不受如克隆技术以及ESCs(来源于胚胎组织)使用的伦理限制，且与ESCs在形态、基因表达谱系、表观遗传谱系、自我更新能力以及多能性等方面表现出高度的相似，甚至不可区分，能够向所有成体细胞、组织、器官分化，使其具备在器官组织细胞移植、肿瘤治疗、遗传病修复、药物筛选等领域能够发挥重要的作用，因此iPSCs的诞生给干细胞与再生医学带来前所未有的一场革命。

我们将重编程因子导入细胞的方式分为病毒和非病毒介导两种，经典的方法采用病毒携带重编程基因，然而由于慢病毒或逆转录病毒会将其基因组插入整合到宿主基因组中，存在染色质不稳定甚至细胞癌变的可能。2008年Stadtfeld等人使用非整合腺病毒载体携载四因子获得了小鼠iPSCs(miPSCs)。2009年，Fusaki等人使用非整合的仙台病毒获得了hiPSCs。尽管如此，有活性的病毒仍然只限于实验研究，仍存在未知的临床风险，Okita等人于2008年报道使用普通真核表达质粒成功地获取了miPSCs，但是普通质粒极易丢失，需要多次转染，造成诱导效率极低，较难得到hiPSCs，不能广泛应用相关研究。2009年俞君英报道使用附加体质粒携带重编程因子获得了hiPSCs，附加体质粒包含OriP/EBNA1(Epstein-Barr nuclear antigen-1)两个DNA元件(本专利所涉及的附加体质粒，统一为包含OriP/EBNA1元件的附加体质粒)，其中EBNA1基因的表达产物可以结合到OriP元件上，使附加体质粒比普通质粒在细胞内能更高效地复制，因此重编程过程中附加体质粒只需转染一次即可，然而附加体大约在2个月后便可完全丢失，迄今该技术已广泛应用于体细胞非整合诱导重编程。然而目前已报道广泛使用的附加体质粒进行体细胞重编程的系统，均包含许多高风险的致癌基因或因子中的至少一个，如c-MYC、SV40-LT、TP53抑制因子等致癌因子，使用这些高风险因子得到的iPSCs可能存在诸如细胞致瘤的风险。iPSCs要在临床上广泛应用，必须得到安全性高且适合大规模制备iPSCs的相关技术。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种安全性高、适合临床应用的非病毒iPSCs诱导组合物。

实现本发明的目的可以通过采取如下技术方案达到：

一种非病毒iPSCs诱导组合物，包括若干重组质粒，所述若干重组质粒是由将表达重编程因子POU5F1、SOX2、GLIS1、KLF4、MYCL和hsa-miR-302s的DNA序列构建到附加体质粒所制得；

所述hsa-miR-302s的DNA序列为包含hsa-miR-302a、hsa-miR-302b、hsa-miR-302c、hsa-miR-302d中的任一种或两种以上的序列。

作为优选，采用II型启动子连接并起始转录POU5F1、SOX2、GLIS1、KLF4和MYCL的表达。

作为优选，采用EF-1α、CMV或CAG启动子连接并起始转录POU5F1、SOX2、GLIS1、KLF4和MYCL表达。

作为优选，采用I型、II型或III型启动子连接并起始转录hsa-miR-302s的表达。

作为优选，采用CMV、U6或H1启动子连接并起始转录hsa-miR-302s的表达。