[发明专利]一种用于海南黄花梨分子鉴定的标准基因及分子鉴定方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及植物分子鉴定的标准基因及分子鉴定方法。

背景技术

海南黄花梨（DalbergiaodoriferaT.Chen），又名降香黄檀，是蝶形花科黄檀属植物，原产于我国海南岛低海拔平原和丘陵地区。因其木质坚实、花纹漂亮且有香味，黄花梨木与紫檀木、鸡翅木、铁力木并称中国古代四大名木，是我国本土出产的两个红木树种之一。因为材质坚硬、美观且具有香味，一直被视为高档木材，因为分布区狭窄，加之过度砍伐，现存数量极少，被列为国家二级保护植物。

因为材质优良，成材周期长，现有木材资源极少，供不应求，其市场价格较高。在巨大的利益驱使下，海南黄花梨的假冒品泛滥，如何准确鉴定海南黄花梨成为海南黄花梨交易市场上的最大难题。现在大多采用显微解剖法来鉴定海南黄花梨，其操作过程复杂，对样品损伤严重，而且随着造假技术的进步，这些方法的鉴定准确率也得不到保证。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供一种用于海南黄花梨分子鉴定的标准基因及分子鉴定方法，应用该方法来鉴定海南黄花梨，具有快速、准确、对样品损伤小等特点，具体技术方案如下。

（1）获取用于海南黄花梨分子鉴定的标准基因

根据DNA条形码技术原理，采用PCR扩增方法。测序结果通过手工校对、序列拼接，并确保所得序列为标准序列。从采集的海南黄花梨样品提取基因组DNA，参考植物条形码DNA片段选取原则，利用引物进行聚合酶链式反应(PCR)，扩增出样品对应的psbK-psbI基因，将扩增产物测序后分析比对，优选引物序列扩增海南黄花梨样品的psbK-psbI基因序列片段作为标准基因，基因序列为序列表所示（471个碱基）。

（2）用psbK-psbI基因序列鉴定海南黄花梨的方法，分为四个步骤：

第一步，取样并提取DNA；

第二步，利用PCR反应扩增psbK-psbI基因序列；

第三步，对扩增产物进行测序；

第四步，将得到的序列与权利要求1中的psbK-psbI基因序列进行同源性比对，当同源性碱基比例小于95%时，排除该物种为海南黄花梨的可能，当同源性碱基比例大于或等于95%时，该样本是海南黄花梨的概率是×100%。

具体实施方式

实验中，用4个不同来源的海南黄花梨样本，用TIANGENE公司DNA提取试剂盒提取样本DNA。采用的正向引物：TTAGCCTTTGTTTGGCAAG，反向引物：AGAGTTTGAGAGTAAGCAT，PCR扩增条件为94℃预变性4min，接下来94℃变性45s，50℃退火45s，72℃延伸1.5min，一共进行35个循环，最后72℃延伸10min。获得产物经测序后比对，样本间的同源性都保持在99%以上，获得序列与其他物种通过在线比对，其同源性都在78%以下。

序列表：

TGCTGTAAGTTTTTGATGAGATTTTGCATTTGAATAAATGTTTGAAAAAAAATTAGGAATTTATTCGAAAACAAAAATTGGAAAAAAAAGATCAGATAAGTCTTACAGTGTGAATCCTCGATTCAAATATGGAAATTCTTGTATATACAAGAGAAGTCCGGACCATCTCATTTTTTCCTCATTTCATTCTTACGCTTTTTTTTTTTCACTGAAAAATCCTTCTATTATTAAATTTGAGTCCACCAGTACTTGGGTTGGGGCTATGAAATAAAATCTTTTGTAATACAAATATTTTATTAATAGTAATAAAGGACTCGGCTCTTACTACAAAAAAATTTGCAAATTTTGTTACATTTCCTTGAAATCACTTTATTTCTGAAAAATTTTGTAACAAAAAAAACAAAATGGGTTAAATAAAAAAATCTATTCTCTTTCTCTGTCTTTTTTTTTTATTATCTGGGGAATTTTGTA。

序列表：

TGCTGTAAGTTTTTGATGAGATTTTGCATTTGAATAAATGTTTGAAAAAAAATTAGGAATTTATTCGAAAACAAAAATTGGAAAAAAAAGATCAGATAAGTCTTACAGTGTGAATCCTCGATTCAAATATGGAAATTCTTGTATATACAAGAGAAGTCCGGACCATCTCATTTTTTCCTCATTTCATTCTTACGCTTTTTTTTTTTCACTGAAAAATCCTTCTATTATTAAATTTGAGTCCACCAGTACTTGGGTTGGGGCTATGAAATAAAATCTTTTGTAATACAAATATTTTATTAATAGTAATAAAGGACTCGGCTCTTACTACAAAAAAATTTGCAAATTTTGTTACATTTCCTTGAAATCACTTTATTTCTGAAAAATTTTGTAACAAAAAAAACAAAATGGGTTAAATAAAAAAATCTATTCTCTTTCTCTGTCTTTTTTTTTTATTATCTGGGGAATTTTGTA