[发明专利]基于柱前衍生的LC-MS测定有机酸含量的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种有机酸测定方法，具体涉及一种基于柱前衍生的LC-MS测定有机酸 含量的方法，属于分析化学领域。

背景技术

有机酸是影响水果风味的一类重要物质，其种类和含量与果品的品质、风味密切相关， 影响着水果的成熟度，包括酒石酸、苹果酸、柠檬酸、琥珀酸等，具有提高机体免疫力、 抑制脑组织脂质过氧化物生成、抗癌等作用。准确分析、测定样品中有机酸的种类和含量， 对根系分泌物中有机酸种类研究以及果实风味特性及品质评价具有重要的意义。

目前，有机酸的测定方法主要包括气相色谱法、高效液相色谱法、离色谱法及气质联 用、液质联用法，其中气相色谱法在检测时需先将有机酸衍生为易挥发物质，操作繁琐且 检测结果准确性较低，而高效液相色谱法虽操作简便、结果重现性好，但由于有机酸极性 较强，在色谱柱上的保留时间较短，难以与杂质有效分离，无法保障检测的灵敏度。加之 水果中有机酸多具有相似的化学结构，光谱性质和pKa值类似，也严重阻碍了分析测定的 进行。

化学衍生化技术是通过化学反应将某特定基团连接到目标化合物上，将其转换为一种 具有新的物化性质的衍生物，再对衍生物进行分析测定，从而间接定性定量目标化合物的 方法。鉴于有机酸中含有羧基基团，其衍生化可借鉴全氟辛酸、丙戊酸钠、γ-羟基丁酸等 的分析检测。一般的，基于LC-MS的衍生化试剂应满足以下3点要求：1)对反应条件要 求不苛刻，能够快速定量；2)与样品中某一组分反应后只针对性地生成一种衍生物，样 品的分离、检测不受反应副产物和过量衍生化试剂的干扰；3)衍生化试剂廉价易得、通 用性良好，与样品反应迅速、有效和具体，能形成相对稳定的衍生物。

公布号CN103698450A的发明专利公开了一种气相色谱-质谱检测细胞内有机酸的方 法，包括：在胞内代谢物样品中加入氨基酸衍生剂，恒温静置后离心取上清，对上清进行 气相色谱-质谱分析，其中氨基酸衍生剂为三甲基氯硅烷的三氟乙酰胺溶液，气相色谱柱采 用HP-5MS或DB-5MS毛细管柱，检测器温度250℃，阶梯式升温至300℃后维持3min， 质谱分析采用EI离子源，检测器为四级杆，电离能70eV，离子源表面温度280℃。该方 法能测定胞内如琥珀酸、苹果酸、柠檬酸等多种有机酸，色谱分析效果良好，但检测结果 准确性及灵敏度还有待提高。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于柱前衍生的LC-MS测定有机酸含量的方法，该方法操 作简便，检测结果准确性好，灵敏度高，成本较低。

为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是：

基于柱前衍生的LC-MS测定有机酸含量的方法，包括以下步骤：

1)将待测样品、碳酸钠和2-溴苯乙酮加入溶剂中，混匀后于50～60℃下衍生化反应 20～28h，冷却备用；

2)取步骤1)中反应产物进行液相色谱-质谱分析，对照标准曲线计算待测样品中有 机酸的含量。

所述有机酸如水果中常见的二元或三元有机酸，如苹果酸、柠檬酸等。

步骤1)中碳酸钠可以与有机酸(如苹果酸、柠檬酸等)发生反应生成柠檬酸钠，相 较有机酸，其钠盐更易与2-溴苯乙酮反应生成衍生产物。

步骤1)中2-溴苯乙酮是化学衍生化试剂，可与有机酸反应生成两种产物，一种是与 有机酸中的一个羧基发生酯化反应的产物1，另一种是与两个羧基发生酯化反应的产物2， 由于产物1在液相色谱分析中难以与杂质有效分离，特选择产物2作定性定量分析。经实 验验证，2-溴苯乙酮过量添加不会对检测结果产生不良影响。

步骤1)中溶剂可采用无水乙腈、乙酸乙酯、四氢呋喃等。优选为无水乙腈，性质较 稳定。经实验验证，无水乙腈添加量或多或少均不会对检测结果产生不良影响。

步骤1)中为促使待测样品(作标准曲线时，取待测有机酸的标准物质)、碳酸钠在无 水乙腈中分散、溶解完全，可先将待测样品(作标准曲线时，取待测有机酸的标准物质)、 碳酸钠溶于少量水中，再于无水乙腈混合。

步骤2)中液相色谱-质谱分析的色谱条件为：色谱柱：安捷伦EclipsePlusC18，规格： 2.1×150mm、3.5μm；流动相：0.1％乙酸水溶液:甲醇(v/v)＝2:3，分析时间：0～12min， 流速：0.2mL/min；进样量：5μL。