[发明专利]用于奶牛乳腺上皮细胞原代培养的细胞体外培养方法

说明书

技术领域

本发明涉及细胞工程技术领域，具体涉及用于奶牛乳腺上皮细胞原代培养的细胞体外培养方法。

背景技术

乳腺上皮细胞是乳腺中唯一具有分泌功能的细胞，是实现泌乳的基础，同时也是构成乳腺先天免疫屏障的重要组成部分，原代细胞无论是形态结构还是生理生化特性方面，都能很好的反映体内的真实情况，适合于生理、病理、药理等方面的研究，乳腺上皮细胞已用于研究泌乳机制、乳房炎发病机制以及药物筛选等，故该细胞成为研究泌乳机制、乳房炎发病机制和药物筛选的重要工具。随着组织培养技术的广泛应用，奶牛乳腺上皮细胞体外培养技术也得到了迅速发展和应用，该技术能够避免体内试验周期长、成本高、条件复杂、且存在个体差异等诸多问题，所以在体外培养时获得细胞状态良好、增殖能力强的奶牛乳腺上皮细胞是众多研究人员的目标。目前奶牛乳腺上皮细胞原代培养主要有四种方法，分别为组织块培养法、机械破碎法、酶消化法以及乳汁分离法。但这些方法均存在一些缺陷。组织块培养法优点是成本低、操作简单、获得的细胞生长增殖能力较强；但是缺点是耗时长，后续纯化工作难度大。机械破碎法的优点是操作简单、成本低、细胞得率较高且生长迅速；缺点是对细胞有一定机械损伤并且后续需要纯化。酶消化法的优势是细胞增殖较快且纯度较高；缺点是酶对细胞会造成一定损伤，所以在操作过程中要严格控制酶的浓度和消化时间。乳汁提取法的优势在于得到的细胞纯度较高、活性好、所需时间短，但该方法依然存在一些问题，如需要正确把握采样时间、对奶的质量和数量要求较高、获得的细胞数量较少、会有部分免疫细胞污染等。所以为了在体外成功获得纯化的奶牛乳腺上皮细胞，本领域技术人员不仅在方法上需要进行改进，而且在组织的选择上和操作的细节方面也需要不断改进。

发明内容

本发明的目的就是针对上述现有技术中的缺陷，提供了一种用于奶牛乳腺上皮细胞原代培养的细胞体外培养方法，不仅确定了奶牛乳腺上皮细胞原代培养的乳腺组织部位选择，而且对原有体外培养方法进行了改进。

为了实现上述目的，本发明提供的技术方案为：用于奶牛乳腺上皮细胞原代培养的细胞体外培养方法，是将奶牛乳腺组织预处理后采用培养瓶侧置法静置贴壁培养30min，再配合组织块回收法进行分离培养，最后采用差时胰酶消化法配合瓶内消化法纯化获得纯化的奶牛乳腺上皮细胞。

进一步的，上述的用于奶牛乳腺上皮细胞原代培养的细胞体外培养方法，所述奶牛乳腺组织为已达到性成熟、无泌乳史的奶牛的乳腺组织的中部。

进一步的，上述的用于奶牛乳腺上皮细胞原代培养的细胞体外培养方法，所述奶牛乳腺组织的预处理方法为：取奶牛乳腺中部组织置于75%的酒精中浸泡3min，用无菌生理盐水浸洗3～4次去除酒精；无菌操作剔除乳腺组织外部泛白的组织、脂肪组织和结缔组织，即得到乳腺上皮细胞的实质组织，然后用D-Hank′s液冲洗3～4次后放入装有适量D-Hank′s液的烧杯中，将实质组织剪成1mm³的小块；用D-Hank′s液将剪碎的小块实质组织清洗干净，弃掉漂浮在上部的组织碎屑，用5mL枪头吸取组织块糊状物；将吸取的糊状组织，铺于瓶底，大小一致，均匀分布，采用培养瓶侧置法静置贴壁培养30min。

进一步的，上述的用于奶牛乳腺上皮细胞原代培养的细胞体外培养方法，所述组织块回收法的操作过程为：取出上述的侧置法静置贴壁培养30min后的培养瓶，用吸管吸除瓶底多余液体，使用移液枪在瓶口缓慢加入完全培养液，覆没组织块，放入二氧化碳培养箱中37℃、5%CO₂培养，培养液变黄时及时更换新鲜培养液；待细胞将要铺满瓶底时，移除组织块，并将移除的组织块重新接种于新的培养瓶中，于培养箱中培养并及时更换新鲜培养液。

进一步的，上述的用于奶牛乳腺上皮细胞原代培养的细胞体外培养方法，所述完全培养液的制备方法为：在DMEM/F12基础培养液中按体积比5:1的比例加入胎牛血清FBS，然后加入抑菌药物，其中青霉素的含量为500U/mL，链霉素的含量为500U/mL，两性霉素B的含量为5μg/mL。