[发明专利]鸡传染性支气管炎病毒nsp5 ELISA抗体检测试剂盒及其应用

权利要求书

1.鸡传染性支气管炎病毒nsp5ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括：

(1)由重组表达的IBV非结构蛋白5包被的96孔酶联反应板；

(2)用样品稀释液稀释的IgG酶标抗体溶液，所述酶标抗体为辣根过氧化物酶标记的羊 抗鸡IgG抗体；

(3)封闭液：含10％犊牛血清的PBS；

(4)洗涤液：含0.05％Tween-20的PBS；

(5)样品稀释液：含5％脱脂奶的PBST；

(6)阳性对照样品：抗IBVnsp5鸡血清；

(7)阴性对照样品：阴性SPF鸡血清；

(8)显色液：A液为底物溶液，含0.1mg/ml四甲基联苯胺溶液，B液为0.05％H₂O₂，使用前 将A液和B液1:1混合；

(9)终止液：2MH₂SO₄；

所述重组表达的IBV非结构蛋白5通过下述方法制备获得：

IBVnsp5的基因经RT-PCR方法扩增获得后，将其克隆到原核表达载体pEGX-4T-1中，转 化大肠杆菌；筛选携带IBVnsp5基因的重组菌，在IPTG诱导下大量表达与GST融合的nsp5重 组蛋白；利用GSTrapFF亲和层析柱纯化，获得提纯后的IBVnsp5重组蛋白，保存于-20℃备 用；

所述IBVnsp5的基因的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示；IBVnsp5的基因编码的氨基 酸序列如SEQIDNO：2所示。

2.权利要求1中所述试剂盒的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)IBVnsp5包被的96孔酶联反应板的制备：

将重组的IBVnsp5蛋白经BCA蛋白检测试剂盒测定浓度后，用pH为7.4的0.01MPBS缓 冲液作为包被液，将其稀释到终浓度为3.64μg/ml；然后按100μl/孔的量加入到96孔酶联反 应板中，于37℃孵育2h或4℃孵育过夜，得到酶联反应板；

(2)封闭：去掉酶联反应板的包被液后，加入200μl/孔的封闭液，37℃孵育1小时，用 PBST洗板一次；

(3)一抗孵育：加入100μl/孔用稀释液以1:200稀释的待检血清，同时设置阳性和阴性 血清对照；37℃孵育1小时，PBST洗板5次；

(4)二抗孵育：加入100μl/孔用稀释液以1:1000稀释的HRP标记的羊抗鸡IgG二抗，37℃ 孵育45分钟，PBST洗板5次；

(5)显色：显色A液和B液等体积混合后，以100μl/孔加入反应孔，在黑暗处显色10分钟；

(6)终止：加入50μl/孔终止液；

(7)结果判定：

酶标仪测定OD450nm读数，按下述公式计算S/P值：

S/P值＝(待测样本OD450nm均值-阴性对照OD450nm均值)/(阳性对照孔OD450nm均值- 阴性对照OD450nm均值)；

如血清样品的S/P值大于0.12，判为IBV抗体阳性，反之则判为阴性。