[发明专利]重组lunasin多肽在毕赤酵母中的诱导表达、纯化以及活性鉴定方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，特别涉及一种在毕赤酵母表达系统制备 lunasin多肽的方法，具体为重组lunasin多肽在毕赤酵母中的诱导表达、纯化 以及生理活性鉴定方法。

背景技术

Lunasin是一种含有43个氨基酸的新型多肽，首次从大豆种子中分离鉴 定。研究表明lunasin具有很多特别的生理活性，包括抗癌和抗炎等。除此以 外，专利201510224932.9公开了lunasin能够通过PPAR通路抑制小鼠前体脂 肪细胞(3T3-L1)分化而具备潜在的减肥活性。然而，在天然作物中，Lunasin 的含量较低，从中分离纯化Lunasin步骤繁琐，且得率较低，这使得大多关于 Lunasin活性的研究都以昂贵的合成Lunasin为原料而限制其进一步研究及应 用。

目前，国内尚无关于如何利用基因工程方法，将Lunasin基因片段克隆转 载到毕赤酵母中，经过诱导表达和纯化步骤生产出高活性真核表达Lunasin的 报到。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种重组lunasin多肽在毕赤酵母中的 诱导表达、纯化以及生理活性鉴定方法，其利用基因工程方法，将Lunasin基 因片段克隆转载到毕赤酵母中，经过诱导表达和纯化步骤生产出高活性真核 表达Lunasin。

本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的：

一种重组lunasin多肽在毕赤酵母中的诱导表达以及纯化方法，包括以下 步骤：

1)重组表达质粒的构建

设计带有EcoRI和NotI酶切位点Lunasin序列，并设计特异性扩增引物， 进行PCR扩增获得目的基因片段。将目的基因片段用限制性内切酶EcoRI酶 和NotI酶进行双酶切，然后将用相同限制性内切酶EcoRI和NotI双酶切的 质粒pPIC9K与酶切后的PCR扩增产物用T4DNA连接酶连接，通过热激转 化到大肠杆菌DH5α中培养扩增，提取得到重组表达质粒pPIC9K-lunasin；

2)筛选高抗性重组基因工程菌株

将重组表达质粒pPIC9K-lunasin经SacI线性化酶切，将经酶切线性化的 重组表达质粒与感受态毕赤酵母GS115细胞按比例12μL：80μL混合后，进 行电击转化获得转化子，将转化子分别接种于MM培养基和MD培养基，经 过PCR鉴定及G418高抗性筛选，阳性克隆为重组工程菌 GS115/pPIC9K-lunasin；

3)重组luansin多肽的发酵生产

将上述获得的G418高抗性的阳性克隆重组工程菌株 GS115/pPIC9K-lunasin接种于BMGY培养基中，在30℃下培养直至OD₆₀₀为 2.0-4.0，离心收集细胞，然后将细胞重悬于BMMY培养基中培养直至OD₆₀₀为1.0-2.0，0.5％甲醇诱导表达；经甲醇诱导重组lunasin多肽的发酵液高速离 心除去细胞后，上清液使用Trish-TricineSDS-PAGE蛋白电泳，鉴定出分子量 5KDa左右的重组lunasin多肽特征条带，以筛选得到高表达lunasin多肽的基 因工程菌株；

4)重组luansin多肽的分离纯化

将上述筛选得到的高表达重组工程菌株再次发酵生产，得到的发酵液经 高速离心除去菌体后，上清中加入CaCl₂溶液，充分混匀后室温静置5min， 高速离心得到沉淀，该沉淀经真空冷冻干燥得重组lunasin多肽粗产物；

将粗产物以浓度为10mg/mL溶解，使用DEAE阴离子交换柱，根据出峰 时间分部分收集洗脱液，真空干燥后，经Trish-TricineSDS-PAGE蛋白电泳， 收集lunasin多肽富集洗脱液，合并后过超滤膜浓缩液。浓缩液经真空冷冻干 燥后得到纯度为93％的重组lunasin多肽。

优选地，上述技术方案中，步骤1)中设计带有EcoRI和NotI酶切位点 Lunasin序列为：