[发明专利]凝血因子XIII的制备方法

说明书

本发明提供一种得率高、纯度高且生产周期短的凝血因子XIII的制备方法，包括血浆血球分离、病毒灭活、硫酸铵分级沉淀、DEAE‑FF层析柱、分装和冻干步骤，其中病毒灭活时加入助剂，在0～4℃环境下进行凝血因子XIII的分级沉降、溶解过程，加入不同的溶解剂对沉淀进行分级溶解，提高溶解效率，缩短生产周期，减少细菌滋生，提高凝血因子XIII得率和纯度。本发明提供的凝血因子XIII的制备方法的有益效果在于：提取效率高，每升血浆能提取10毫克以上的凝血因子XIII；制得的凝血因子XIII冻干制品中，凝血因子XIII纯度在90％以上；操作简单，生产周期短，在2天时间内即可完成凝血因子XIII的制备。

技术领域

本发明属于医药生物工程领域，尤其涉及一种以人类血液或哺乳动物血液为原料制备医用凝血因子XIII的方法。

背景技术

凝血因子XIII(又称纤维蛋白稳定因子、纤维蛋白连接酶、转谷氨酰胺酶)是以酶原(A₂B₂四聚体，M_r≈320KD)形式存在于血浆中的一种糖蛋白，是正常凝血所必需的一种血浆蛋白酶，被激活后发挥转氨酶的作用，可催化可溶性纤维蛋白单体(sFM)分子间的交联反应，形成γ链二聚体以及大分子量的α链多聚体，增加血块强度，加速伤口愈合。

目前国内外的凝血因子XIII的制备主要从人血浆、酵母细胞中提取，还有从血小板、胚胎中提取，临床上使用时再经凝血酶催化，在Ca²⁺参与作用下，转变成具有活性的A₂结构，催化纤维蛋白凝胶进一步共价交联成不溶的血纤维蛋白凝块。

凝血因子XIII制品可从人或动物猪血液中提取，我国是畜牧大国，养猪业规模较大，猪血资源十分丰富，由于生产工艺不够成熟，导致目前我国猪血的利用率很低。从猪血中提取FXIII既可以充分利用猪血资源，又可以减少因排放而造成的环境污染。FXIII的缺乏会导致迟发性出血、表面擦伤出血、皮下血肿、组织损伤出血、口腔粘膜和牙龈出血常见，更为常见的是运动损伤或肌肉注射引起肌肉血肿。此外，FXIII对治疗手术后伤口愈合紊乱、硬皮病、溃疡性结肠炎、伪膜性结肠炎等很有效。FXIII也是组织粘合剂的重要成分之一。

凝血因子XIII是一种糖蛋白，一般的凝血因子XIII的提取包括六个基本步骤，即血浆血球分离、病毒灭活、硫酸铵分级沉淀、DEAE-FF层析柱、进行分装和冻干，最后经干热病毒灭活和钴-60辐照。但是上述工艺存在以下缺陷：

生产的过程中三次溶解的时间太长，这个过程中容易导致细菌等微生物繁殖，从而增加产品中热原等毒素的含量；溶解时间过长也容易造成活性损失，同时延长生产周期，增加成本；上述工艺制得的产品，纯度不高，活性较低。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：提供一种得率高、纯度高且生产周期短的凝血因子XIII的制备方法。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：凝血因子XIII的制备方法，包括如下步骤：

步骤1、向血液中加入抗凝剂后离心分离，取上清抗凝血浆；

步骤2、向上清抗凝血浆中加入磷酸三丁酯和吐温-80作为病毒灭活剂，并加入助剂，进行S/D病毒灭活，得灭活后的血浆；

步骤3、将步骤2所得灭活后的血浆离心，取清液；

步骤4、将步骤3所得清液预冷至0～4℃，加入0～4℃的饱和硫酸铵溶液后，取沉淀；

步骤5、将步骤4所得沉淀用0～4℃的饱和硫酸铵溶液洗涤，将洗涤后的沉淀破碎并加入0～4℃的一次溶解剂并搅拌，取清液，所述一次溶解剂为氯化钾溶液；

步骤6、将步骤5所得清液预冷至0～4℃，加入0～4℃的乙酸体积分数为94％～96％的乙酸溶液至溶液pH为5.2～6.5后，加入硫酸铵固体至溶液饱和度为15％～20％，取沉淀；