[发明专利]一种免疫缺陷小鼠模型、其制备方法及应用

说明书

技术领域

本发明属于动物基因工程技术领域，具体涉及一种免疫缺陷小鼠模型、其制备方法及应用。

背景技术

肝脏在人体发挥解毒和代谢外源化合物功能中占领着战略性的地位。由于小鼠饲养成本低、繁殖速度快、实验周期段短、遗传背景清晰、实验重复性高等优点，研究人员利用小鼠构建各种小鼠肝脏疾病模型，如肝损伤、病毒性肝炎、肝纤维化、肝癌等，进行肝脏疾病研究。但这些模型难以弥补人和小鼠存在巨大种属差异(例如，很多肝脏代谢酶具有种属特异性，一些人肝脏病毒如HBV、HCV等无法感染小鼠肝脏细胞)在这些模型上获得的研究成果或治疗药物无法在人体上重现相同效果。而利用人体肝脏细胞体外培养进行研究，则局限于人体原代细胞体外存活期限、冻存技术和无法重现体内器官协作。

于是，研究人员开展了肝脏人源化小鼠研究。肝脏人源化小鼠模型，即在可诱导肝脏损伤的免疫缺陷小鼠体内移植并重建人体肝脏组织或器官。肝脏人源化模型所使用的受体小鼠免疫缺陷程度越高，对异种、异体移植物的排斥则越小；且免疫细胞参与肝脏损伤引起的炎症反应，若免疫系统完善，则在诱导肝脏损伤而人源肝脏组织或器官未重建的同时加速肝脏衰竭，提高小鼠死亡率。此外，可控的诱导性小鼠肝脏细胞损伤对移植的人源肝脏细胞的生存、增殖和发育提供了足够的空间。

现有技术中最优的可诱导肝脏损伤的免疫缺陷小鼠：TK-NOG(Thymidine Kinase即胸苷嘧啶激酶缺陷的NOD-Scid IL2rg-/-)免疫缺陷小鼠(Masami Hasegawa et al.,2013)、uPA-SCID(urokinase-type Plasminogen Activator即尿激酶纤维蛋白融酶原激活剂缺陷的Scid)免疫缺陷小鼠(Mercer et al.,2001)、FRG(Fah-/-Rag2-/-il2γc-/-)和FRGN(Fah-/-Rag2-/-il2γc-/-NOD)免疫缺陷小鼠(Hisaya Azuma et al.,2007；Elizabeth M.Wilson et al.,2014)。然而，TK转基因雄性小鼠不育，仅能通过杂合雌鼠和野生型雄鼠，无纯合小鼠品系，而uPA小鼠对供体肝脏细胞的要求非常高，且uPA基因缺失可引起迅速而严重的肝脏损伤，具有不可控的选择性。基于Fah基因敲除的肝脏诱导损伤小鼠，如FRG、FRGN，是目前应用最广泛、可控性最好、高移植效率的肝脏模型工具，可通过护肝药物NTBC(2-硝基-4-三氟甲苯-1，3环己二酮)控制Fah缺失诱导的肝脏损伤(Grompe et al.,1995；)。

然而，FRG和FRGN小鼠的免疫基因缺陷背景Rag2-/-IL2rg-/-和NOD Rag2-/-IL2rg-/-并非现有技术中免疫程度最高的，在构建肝脏人源化小鼠模型中，将会对外源的异种(人体)、异体细胞产生一定的排斥作用影响移植效率。Wei Ye et al.,Journal of Hematology&Oncology 2015报道发现NOD-scid IL2rg-/-小鼠的免疫缺陷程度最高，构建人源化小鼠模型的效果最好。基于NOD-scid IL2rg-/-免疫缺陷背景的Fah敲除小鼠将是最好的肝脏疾病人源化小鼠模型工具。然而，在探索该基因型小鼠研发上，研究人员却遇到了一系列困难。由于NOD((non-obese diabetic)小鼠基因背景复杂且自发非肥胖性糖尿病，在NOD小鼠上进行基因敲除可能会诱发致死或糖尿病病发(Baxter AG et al.,1995；Nichols J et al.,2009；)。再则，scid(Severe Combined Immunodeficiency Disease)小鼠Prkdc基因缺陷，DNA修复能力部分缺失，影响基因敲除工具脱靶后的基因修复，提高基因敲除小鼠的死亡率，且有研究人员发现NOD-scid Fah-/-小鼠在NTBC(肝脏保护药)停药之后，肝脏迅速衰竭，小鼠死亡(Blunt,T.et al., 1996)。而NOD-scid IL2rg的基因背景缺陷程度更高于NOD和NOD-scid小鼠。

此外，目前所有的高度免疫缺陷小鼠(缺失B、T、NK等免疫细胞)，包括NOD-Scid IL2rg-/-、Rag2-/-IL2rg-/-、Rag1-/-IL2rg-/-等，在构建肿瘤模型上都具有极高的效率，然而这些小鼠都有毛发，在利用活体成像等技术检测带有荧光标记(特别是荧光蛋白)的肿瘤细胞体内生长和分布时，毛发对于检测结果都具有严重的干扰。

发明内容