[发明专利]一种免疫缺陷小鼠模型、其制备方法及应用

权利要求书

1.一种基因敲除的方法，其特征在于，所述方法采用NOD-Scid IL2rg-/-免疫缺陷型小鼠(NSI小鼠)，敲除Fah基因或Foxnl基因。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述Fah基因的核苷酸靶点序列为SEQ ID NO.1所示，所述Foxn1基因的核苷酸靶点序列为SEQ ID NO.2所示。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述敲除Fah基因包括如下步骤：

(1)TALEN质粒的构建，获取TALEN mRNA；

(2)获取NSI小鼠受精卵，将步骤(1)得到的TALEN mRNA原核注射入NSI小鼠受精卵胞质，培养24h后，移植入假孕小鼠子宫，获得嵌合或杂合NSIF(NOD-scid IL2rg-/-Fah-/-)免疫缺陷小鼠；

(3)将步骤(2)得到的嵌合或杂合NSIF免疫缺陷小鼠与NSI小鼠杂交获得更多杂合NSIF免疫缺陷小鼠，杂合NSIF免疫缺陷小鼠杂交以获得NSIF纯合免疫缺陷小鼠；

优选地，所述步骤(1)所述的TALEN质粒的构建包括如下步骤：根据Fah基因的靶点序列分别得到TALEN左臂识别序列和TALEN右臂识别序列，设计TALEN左臂和右臂结构，再将重复序列连接到TALEN表达载体上，获得pCAG-TALEN L(左臂)-X-pA和pCAG-TALEN R(右臂)-X-pA质粒；

优选地，所述TALEN左臂识别结合序列为SEQ ID NO.7，所述TALEN右臂识别结合序列为SEQ ID NO.8；

优选地，所述TALEN mRNA的获取包括如下步骤：

优选地，步骤(2)所述的注射入NSI小鼠受精卵胞质的TALEN mRNA的浓度为10-200ng/μL，优选为12-100ng/μL，进一步优选为20ng/μL；

优选地，所述敲除Fah基因的NSI小鼠受精卵的胚胎操作所用培养基为10-40mmol/L的HEPES，pH 7.0-8，非必需氨基酸为0.05-1mmol/L，必需氨基酸为0.1-2mmol/L，优选为20mmol/L的HEPES，pH 7.4-7.8，非必需氨基酸为0.1mmol/L，必需氨基酸为0.1-0.6mmol/L；

优选地，所述敲除Fah基因的小鼠胚胎培养所用培养基为丙酮酸浓度0.1-2mmol/L，谷氨酰胺浓度0.5-3mmol/L，葡萄糖浓度0.01-1mmol/L，优选为丙酮酸浓度0.35mmol/L，谷氨酰胺浓度1mmol/L，葡萄糖浓度0.1mmol/L；

优选地，步骤(2)所述的移植入假孕小鼠子宫的受精卵数量为10-20枚，优选为10-15枚；

优选地，所述假孕小鼠为NOD小鼠、NOD-SCID小鼠或NSI小鼠中的任意一种；

优选地，所述敲除Fah基因的方法还包括选择一种代养小鼠进行哺乳新生小鼠；

优选地，所述代养小鼠为ICR小鼠。

4.一种如权利要求3所述的基因敲除的方法敲除Fah基因后得到的NSIF小鼠模型。

5.一种免疫缺陷小鼠模型，其特征在于，所述小鼠在权利要求4所述的NSIF小鼠的基础上进一步进行基因改造。

6.如权利要求4或5所述的小鼠模型作为肝脏疾病研究和/或肝脏人源化的模型鼠的用途。