[发明专利]用于定量检测小菜蛾颗粒体病毒的质粒标准分子及其应用

说明书

本发明提供一种用于定量检测小菜蛾颗粒体病毒的质粒标准分子，所述质粒标准分子含有SEQ ID NO:1所示的序列，其含有小菜蛾颗粒体病毒基因组中编码PxORF30蛋白(NCBI中的序列号：NP_068249.1)保守区域的222bp基因片段。本发明还提供了用于特异性扩增SEQ ID NO:1所示的序列的引物序列。本发明提供了量值可以溯源的小菜蛾颗粒体病毒质粒标准分子，不仅可以定量检测小菜蛾颗粒体病毒，而且可以提高检测的准确性、可靠性。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及用于定量检测小菜蛾病毒的质粒标准分子、相关试剂盒及其用途。

背景技术

小菜蛾颗粒体病毒(Plutella xylostella granulovirus，PxGV)隶属杆状病毒科颗粒体病毒属，对小菜蛾(Plutella xylostella(L.))具有较强的致病和杀灭作用。光学显微镜下观察，病毒包涵体呈强折光性的颗粒；电子显微镜观察，包涵体呈长椭圆形，大小为320×185nm，内部含有1个病毒粒子，由分子量为85kb的双链DNA和蛋白衣壳组成；病毒感染力主要由DNA和蛋白衣壳的完整性决定，病毒粒子外包裹了致密晶格的颗粒体蛋白，形成病毒的包涵体。病毒包涵体可以加工成环保安全的生物杀虫剂，用于防治小菜蛾。

小菜蛾是发生在十字花科蔬菜上最具破坏性的世界性害虫之一，因其生长周期短、发生代数多、防治次数频繁，是目前抗药性最为严重的害虫之一，在防治上难度很大。小菜蛾颗粒体病毒具有较强的专化性，害虫不易对其产生抗性；其病毒的后效作用明显，当环境条件适合时，患病虫体内扩增的病毒释放到小菜蛾种群中可以造成病毒病的流行。把小菜蛾颗粒体病毒制成生物农药用于防治小菜蛾，效果非常显著。目前，小菜蛾颗粒体病毒原药和制剂已取得农药登记许可，并在在国内外均已得到了广泛应用，但由于颗粒体病毒自身特点所限，其颗粒体病毒产品的病毒粒子的精确定量一直困扰着产品的标准化。目前仍然使用显微计数法用于原药的检测，由于小菜蛾颗粒体病毒粒子过小，仅0.5μm，即使原药也难以准确计数，而病毒制剂更无法直接检测，必须通过生物测定的方法确定。

迄今国内外尚未制定统一可行的小菜蛾颗粒体病毒的检测方法，而且针对小菜蛾颗粒体病毒进行定量检测的标准质粒也尚未报道。目前亟需建立一种简便快捷、灵敏度高、重复性好的检测方法。

发明内容

因此，本发明的目的是提供一种用于定量检测小菜蛾颗粒体病毒的质粒标准分子，在使用实时荧光定量PCR法对小菜蛾颗粒体病毒进行定量检测时，该小菜蛾颗粒体病毒质粒标准分子被用作阳性标准品，本发明的质粒标准分子使用方便，可以满足当前对小菜蛾颗粒体病毒定量检测的需求。

本发明是通过以下的技术方案实现的。

一方面，本发明提供了一种用于定量检测小菜蛾颗粒体病毒的质粒标准分子，其特征在于，所述质粒标准分子含有SEQ ID NO:1所示的序列。

优选地，将SEQ ID NO:1所示的序列构建到T质粒载体上，得到本发明所述的质粒标准分子。

优选地，所述质粒载体为pEASY-T1。

其中，所述SEQ ID NO:1所示的序列含有小菜蛾颗粒体病毒基因组中编码PxORF30蛋白(NCBI中的序列号：NP_068249.1)保守区域的222bp基因片段。

另一方面，本发明提供了一种用于定量检测小菜蛾颗粒体病毒的试剂盒，其中所述试剂盒包括：

本发明所述的包含SEQ ID NO:1所示的序列的质粒标准分子；

优选地，所述试剂盒还包括用于特异性扩增SEQ ID NO:1所示的序列的引物序列；

优选地，所述引物序列如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示。