[发明专利]一种番茄黄曲叶病毒LAMP检测试剂盒及检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及微生物检测领域，具体地说，本发明涉及一种番茄黄 曲叶病毒LAMP检测试剂盒及检测方法。

背景技术

番茄是常见的可食用植物，其营养丰富、风味特别，具有减肥瘦 身、消除疲劳、增进食欲、促进蛋白质消化等功效，原产南美洲，在 我国广泛栽培。然而，1964年Cohen等首次报道了在以色列发生的 番茄黄曲叶病毒病。在之后的几十年间，该病迅速地扩散到中东、地 中海沿岸、东亚、南亚、非洲、欧洲、美国、中美洲、澳大利亚等众 多国家和地区。2002年传入我国南部省份，首先在广西大面积暴发, 同年传入江浙一带,随后在各个省份相继发现、连续暴发，给我国的 番茄生产造成重大损失。

番茄黄曲叶病毒病的病原体是番茄黄曲叶病毒(Tomatoyellow leafcurlvirus,TYLCV)，是对番茄产量影响最严重的病害之一，主要 由烟粉虱传播。番茄植株感染该病毒后,最典型的症状是病株生长迟 缓或停滞，节间变短，严重矮化，枝条直立丛簇，叶片明显变小、增 厚、皱缩，叶质脆硬，向上卷曲呈杯、盘状，植株顶部形似菜花；病 叶边缘至叶脉区域黄化，植株上部叶片症状尤其明显；大部分花穗凋 萎，结果稀少，果实变小，膨大速度慢，成熟期的果实不能正常转色。 番茄在开花以前遭受TYLCV侵染，危害极其严重，果实产量和商品 价值均大幅度下降,严重时造成的损失可达100％。

番茄黄曲叶病毒病的症状并不是一成不变的，而是随着病毒株 系、番茄品种、植株年龄以及侵染时间的不同而改变，难以鉴别。此 外，番茄病毒病的种类很多，经常是多种病毒同时发生，如黄瓜花叶 病毒(CMV)、番茄花叶病毒(ToMV)等，构成混合侵染，因此田 间症状往往十分复杂，不易辨认。目前检测番茄黄曲叶病毒多使用血 清学测定或PCR法，然而这两种方法均存在不足：前者须制作抗血 清，非特异反应多，易产生假阳性或假阴性结果，而PCR灵敏度和 特异性不高，导致检测结果的准确性较低。因此，有必要开发一种快 速、准确的TYLCV检测方法，以满足产业需求。

环介导恒温核酸扩增技术(loop-mediatedisothermalamplification, LAMP)是近些年发展起来的一种新型的核酸扩增方法(见文献 NotomiT,OkayamaH,MasubuchiH,YonekawaT,WatanabeK,Amino N,HaseT.Loop-mediatedisothermalamplificationofDNA.Nucleic AcidsRes.2000Jun15；28(12):E63)。该技术不仅能够在恒温条件下 对目的序列进行快速扩增，且与常规PCR相比，无需高端的仪器设 备，可以通过在扩增产物中加入荧光染料进行直接判断或者通过观察 扩增曲线变化判断扩增结果，因此具有特异性强、灵敏度高、易于判 读、可定性定量等优势。目前LAMP技术已经应用于多种动植物病 毒的快速检测，并随着该技术的成熟，使用范围也越来越广。

发明内容

本发明的目的在于提供一种番茄黄曲叶病毒LAMP检测试剂盒 及检测方法。

为了实现本发明的目的，在一个方面中，本发明提供一种番茄黄 曲叶病毒LAMP检测试剂盒，其包括特异性引物、反应缓冲液、Bst DNA聚合酶和核酸染料，其中所述引物的核苷酸序列如下所示:

外引物F3：TGAAGAATGATTTGCGGGATA(SEQIDNO:1)

外引物B3：GCATGCGTACATGCCATA(SEQIDNO:2)

内引物FIP：CCTGTTCCTTCATTCCAGAGGG-TTCAAGTGA

TGAGGAAATTTCATG(SEQIDNO:3)

内引物BIP：ACGTAACTTATAATCATCAGGAGGC-CAATAA

CAAGGCGTTTTCAGT(SEQIDNO:4)。

优选地，所述外引物F3和所述外引物B3的浓度均为5pmol/μl， 所述内引物FIP和所述内引物BIP的浓度均为40pmol/μl。

优选地，所述反应缓冲液由10mMdNTP、10×ThermoPol反应缓 冲液、5mM甜菜碱和50mMMgSO₄组成。

优选地，所述核酸染料为SYBRGreenI。