[发明专利]一种整合型慢病毒载体表达系统

说明书

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种适合肿瘤细胞研究的整合型慢病毒载体表达系统。本发明提供一种整合型慢病毒载体表达系统，包括KL15490载体、pHelper 1.0载体和pCMV‑VSV‑G载体和宿主细胞，将系统中的KL15490载体、pHelper 1.0载体和pCMV‑VSV‑G载体共同转染宿主细胞后，即在宿主细胞中包装获得慢病毒载体。本发明所提供整合型慢病毒载体表达系统中所使用的慢病毒载体骨架小，独立表达EGFP和Puromycin，可以插入的外源基因长达4000bps，而且包装的病毒滴度高，能够提供高效的基因转移、长期的基因表达，特别适合肿瘤细胞。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种适合肿瘤细胞研究的整合型慢病毒载体表达系统。

背景技术

慢病毒作为一种特殊的逆转录病毒,与通常使用的逆转录病毒载体和腺病毒载体比较,具有可感染分裂细胞及非分裂细胞、转移基因片段容量较大、目的基因表达时间长、不易诱发宿主免疫反应等优点,已成为当前基因治疗和转基因动物中载体研究的热点，并已经应用于多种疾病的基因治疗研究中。

典型的慢病毒载体系统为HIV-1载体系统，它由两部分组成，即包装成分和载体成分。包装成分由HIV-1基因组去除了包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列而构建，能够反式提供产生病毒颗粒所必需的蛋白；载体成分则与包装成分互补，即含有包装、逆转录和整合所需的HIV顺式作用序列，同时具有异源启动子控制下的多克隆位点及在此位点插入的目的基因。

为了确保慢病毒载体的安全性、提高其滴度和转导能力，现有的研究从多个方面如包膜蛋白、包装成分、载体质粒等对其进行了改进。

最初的HIV-1载体颗粒，均由其本身的包膜蛋白Env所包裹，仅对CD4+的细胞具有亲嗜性。1996年，Trono课题组的Naldini等设计的HIV-1载体系统采用表达水疱性口炎病毒(VSV)糖蛋白G的质粒和双嗜性小鼠白血病病毒(MLV)包膜蛋白Env的质粒，分别取代表达HIV本身包膜蛋白Env的质粒，使HIV-1载体颗粒包上了VSV或双嗜性MLV的包膜。这样做的结果至少具有三个方面的积极意义：①包膜的更换进一步降低了HIV-1载体恢复成野生型病毒的可能；②使HIV载体感染宿主的范围不再仅限于CD4+细胞，而扩大到几乎能感染所有组织来源的细胞；③VSV的包膜赋予HIV载体颗粒高度的稳定性，使其能够通过超速离心而浓缩，达到高滴度。Naldini等已使HIV-1载体滴度由10⁵转录单位(TU)/ml达到10⁸TU/ml。这样的改进无疑是HIV载体系统走向应用而迈出的一大步。Naldini等在构建包装质粒pCMVΔR9和pCMVΔR8.2时，分别在env基因阅读框架前插入了多个终止密码子或删除了env基因中1.4kp的序列，代之以终止密码子，以阻止env基因的表达。在此基础上，Zufferey等将包装质粒上表达调节蛋白Nef、Vif、Vpr和Vpu的4个基因分别删除或联合删除，结果发现它们对于 产生HIV-1载体颗粒是非必需的，即使完全删除，得到的载体颗粒仍具备转导非分裂细胞的能力。这4个调节蛋白或已被证实、或被高度怀疑是构成HIV毒性的因素，将其删除、加上包膜蛋白的替换，可使制备HIV载体过程中产生野生型病毒的可能必微乎其微。载体质粒上HIV-1的顺式序列通常包括两端的LTR、剪切位点及包装信号Ψ等。此外，研究表明，gag基因5′端的序列可提高载体RNA的包装效率；Rev蛋白需要与Rev反应元件(RRE)相作用，将未剪切的载体转录产物从细胞核转运到胞浆。因此，Naldini等在载体上保留了gag基因5′端350bp的序列及位于env序列中的RRE，提高了产生载体颗粒的能力。

但是，现有的载体质粒能够插入的外源基因比较小，没有同时携带荧光蛋白和真核抗性，而且就算有类似的载体，荧光蛋白也会比较弱，也无法保证病毒的滴度，给研究工作带来极大的麻烦，正是基于这个原因，我们改造了适合肿瘤细胞研究的整合型慢病毒载体系统。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种适合肿瘤细胞研究的整合型慢病毒载体表达系统，用于解决现有技术中的问题。