[发明专利]一种适于牙鲆性腺冰冻切片mRNA原位杂交的方法

说明书

技术领域

本发明涉及mRNA原位杂交技术，具体的说是一种适于牙鲆性腺冰冻切 片mRNA原位杂交的方法。

背景技术

牙鲆，俗称牙片，为鲆鲽鱼类，录属于鲽形目、牙鲆科、牙鲆属，是 我国和日韩等国的重要海水养殖鱼类。牙鲆具有雄鱼比雌鱼生长快、个体 大的特点，牙鲆已逐步在性别决定与分化研究领域成为海水经济鱼类模式 物种，研究其性别决定与分化的机制，确定性别决定与分化相关的基因， 并以此为基础，对其实施性别控制，具有重要的理论和实践意义。通过牙 鲆性腺冰冻切片mRNA原位杂交可以解析性别决定和分化相关基因的表达模 式及相互关系，但由于直接进行mRNA整体原位杂交非常困难，使得该技术 难以应用。因此建立牙鲆性腺冰冻切片mRNA原位杂交的方法，对于牙鲆性 别决定和分化相关规律的阐述具有重要的意义；另外该发明在其它鱼类性 腺等组织的原位杂交进行基因定位和功能研究方面将有一定应用前景，甚 至可以开发相关检测试剂盒而进行产业化生产。

发明内容

本发明在于提供一种适于牙鲆性腺冰冻切片mRNA原位杂交的方法。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种适于牙鲆性腺冰冻切片mRNA原位杂交的方法：

1)将牙鲆性腺依次经过量浓度为4％PFA溶液固定和100％甲醇溶液通 透，而后长期保存；固定后保存的样品经复水、20-30％蔗糖沉降后，进行 OCT包埋和冰冻切片，55℃干燥2-3h，获得冰冻切片作为原位杂交样品；

2)上述样品经过量DEPC水洗涤3-5min以除去样品切片OCT包埋剂； 洗涤、蛋白酶K消化、固定而后经预杂交，预杂交后与含有牙鲆RNA探针 的杂交液混合于50-70℃下杂交过夜；杂交处理后洗涤，并经抗体孵育，再 洗涤，避光显色，终止显色，再固定，封片，进而实现对牙鲆性腺相关基 因在mRNA水平的表达定位。

所述固定后样品经过量浓度100％甲醇溶液洗涤后再用100％甲醇溶液于 -20℃长期保存。

将原位杂交样品经过量DEPC水洗涤3-5min以除去OCT包埋剂；洗涤 后用过量无RNA酶的1×PBST缓冲液洗涤反复洗涤，洗涤后加入蛋白酶K(10 μg/ml)于37℃消化处理3-20min，消化处理后于过量浓度为4％PFA溶液 再固定20-60min，固定后经过量无RNA酶的1×PBST缓冲液反复洗涤；洗 涤后用PAP笔圈出样品区域，使样品与过量预杂交液于50-70℃预杂交 2-5h。

所述预杂交液为50(v)％去离子甲酰胺，25(v)％20XSSC(生工，中国)， 50μg/ml肝素，500μg/ml酵母tRNA，0.1(v)％Tween-20，1M的柠檬酸 460μl，加无RNA酶水定容至50ml。

所述含有牙鲆RNA探针的杂交液是将用预杂交液稀释RNA探针至终浓 度为1-2ng/μl，再将其置于80℃变性30min，变性后，待用。

所述探针为RNA探针，是以在性腺内表达基因的cDNA为模板构建探针 载体，在体外转录合成的带有地高辛标记的、并与该基因的核苷酸序列互 补结合的一段单链cRNA分子。其中，nr5a2、nr0b1、cyp19a、dmrt1、foxl2 等性腺发育相关基因均可用来构建并合成RNA探针。

所述预杂交后样品与含有牙鲆RNA探针的杂交液混合于50-70℃下杂交 过夜后于50-70℃下依次预杂交液(不含肝素和酵母tRNA)快速漂洗一次 (5-20min)、漂洗后用过量的体积比为1:1的预杂交液(不含肝素和酵母 tRNA)和2×SSC混合液洗涤5-20min、再用过量2×SSC洗涤10-30min、 再用过量含0.1CHAPS的0.2×SSC两次洗涤，每次15-30min；最后在室 温下用MAB溶液洗涤5-10min。

所述MAB溶液为100mM马来酸，150mMNaCl，pH7.5。

所述杂交处理洗涤后，样品用过量封闭液于室温下水平摇床封闭2-4h， 而后加入碱性磷酸酶抗体在4℃孵育过夜，再洗涤，避光显色，终止显色， 再固定，封片，进而实现对牙鲆性腺相关基因在mRNA水平的表达定位。

本发明具有如下优点：