[发明专利]一种蜱传莱姆病伯氏疏螺旋体检测试剂及应用

权利要求书

1.一种蜱传莱姆病伯氏疏螺旋体检测试剂，其特征在于所述检测试剂由 狭义伯氏疏螺旋体全菌抗原和伽氏疏螺旋体全菌抗原组成。

2.如权利要求1所述蜱传莱姆病伯氏疏螺旋体检测试剂，其特征在于所 述狭义伯氏疏螺旋体全菌抗原和伽氏疏螺旋体全菌抗原体积比为1:1。

3.如权利要求1所述蜱传莱姆病伯氏疏螺旋体检测试剂，其特征在于所 述狭义伯氏疏螺旋体全菌抗原制备方法为：将狭义伯氏疏螺旋体菌株接种至 BSK-II培养基，在33-37℃、5％CO₂恒温培养箱培养至菌体浓度1-2×10⁸个 /ml，获得培养液；然后将培养液在4℃，3200rcf离心25min，收集沉淀并用 质量浓度0.9％NaCl水溶液重悬清洗两次，最终获得菌体沉淀用2×SDS上样 缓冲液在沸水浴中裂解10min，4℃离心，取上清，获得狭义伯氏疏螺旋体全 菌抗原。

4.如权利要求1所述蜱传莱姆病伯氏疏螺旋体检测试剂，其特征在于所 述伽氏疏螺旋体全菌抗原制备方法为：将伽氏疏螺旋体菌株接种至BSK-II培 养基，在33-37℃、5％CO₂恒温培养箱培养至菌体浓度1-2×10⁸个/ml，获得 培养液；然后将培养液在4℃，3200rcf离心25min，收集沉淀并用质量浓度 0.9％NaCl水溶液重悬清洗两次，最终获得菌体沉淀用2×SDS上样缓冲液在 沸水浴中裂解10min，4℃离心，取上清，获得伽氏疏螺旋体全菌抗原。

5.一种权利要求1所述蜱传莱姆病伯氏疏螺旋体检测试剂在检测蜱传莱 姆病伯氏疏螺旋体中的应用。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述检测方法为：将狭义伯氏 疏螺旋体全菌抗原和伽氏疏螺旋体全菌抗原分别进行SDS-PAGE蛋白分离， 获得SDS-PAGE分离的全菌抗原，将SDS-PAGE分离的全菌抗原通过半干转 方法转移至同一微孔基膜上，转膜条件为0.8mA/cm²，35-40min，获得含有 两种基因型全菌抗原的微孔基膜；将含有两种基因型全菌抗原的微孔基膜与 待检测血清采用WesternBlot杂交方法进行检测，若特异性阳性杂交蛋白在 17KDa、23KDa、34KDa、41KDa、44KDa、58KDa处出现2条及以上阳性 条带，则待测血清含有莱姆病伯氏疏螺旋体。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述微孔基膜为0.2μm孔径硝 酸纤维素膜。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于所述WesternBlot杂交方法按 如下步骤进行：(1)将含有两种基因型全菌抗原的硝酸纤维素膜放入封闭液 中，室温振荡封闭30-60min；所述封闭液为含有质量浓度5％脱脂牛奶的 1×PBST溶液；(2)在步骤(1)所述封闭液中加入待检血清，室温振荡孵 育1-2h；所述待检血清与封闭液体积比为1：100；(3)取出硝酸纤维素膜， 用1×PBST溶液振荡洗膜3次，每次5min，得洗涤后的硝酸纤维素膜；(4) 在封闭液中加入兔抗大鼠IgG(H+L)-HRP，放入步骤(3)洗涤后的硝酸纤维 素膜，室温振荡孵育1-2h；所述兔抗大鼠IgG(H+L)-HRP与封闭液体积比为 1：5000；(4)重复步骤(3)；(5)将步骤(4)洗涤后的硝酸纤维素膜置 于显色液中显色，4-氯-1-奈酚为显色底物；(6)双蒸水冲洗步骤(5)处理 后的硝酸纤维素膜终止反应；若特异性阳性杂交蛋白在17KDa、23KDa、 34KDa、41KDa、44KDa、58KDa处出现2条及以上阳性条带，则待测血清 含有莱姆病伯氏疏螺旋体。