[发明专利]一种Cronobacter sakazakii的类脂A结构突变株的构建及其应用

说明书

本发明公开了一种Cronobactersakazakii的类脂A突变株的构建及其应用，属于基因工程技术领域。本发明通过将Cronobacter sakazakii菌株的ESA‑02008基因片段进行敲除，使Cronobacter sakazakii菌株对阳离子抗菌肽抗性降低了32倍、Cronobacter sakazakii细胞毒性降低了27％、Cronobacter sakazakii菌株在巨噬细胞中的繁殖水平显著降低，同时还得到了发生结构突变的类脂A。本发明的结构突变的类脂A的修饰完全缺失。

技术领域

本发明涉及一种Cronobactersakazakii的类脂A突变株的构建及其应用，属于基因工程技术领域。

背景技术

类脂A可以被宿主细胞表面的Toll样受体4(Toll Like Receptor 4，TLR-4)识别，继而引发细胞内一系列的生理生化反应，产生TNF-α、IL-6、IL-8等多种炎性细胞因子。细胞因子的种类和数量主要取决于类脂A的结构，因此，某些特殊结构的类脂A可作为疫苗佐剂，非特异性的增强机体对抗原的免疫应答反应，提高疫苗效率。

阪崎克罗诺肠杆菌(Cronobacter sakazakii)是一种自然界中广泛存在的食源性革兰氏阴性致病菌，主要污染婴儿配方奶粉。它可以引起新生儿脑膜炎、败血病、菌血症及坏死性小肠结膜炎等疾病。近些年的研究表明，有些革兰氏阴性菌的致病能力与其外膜类脂A的分子结构密切相关，但关于阪崎克罗诺杆菌类脂A分子修饰及作用还有待研究。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供C.sakazakii的类脂A分子修饰相关的突变株。

本发明的第一个目的是提供一种Cronobacter sakazakii的基因工程菌，所述基因工程菌缺失了ESA-02008基因片段。

在本发明的一种实施方式，所述ESA-02008基因片段的核苷酸序列是SEQ ID NO:1的序列。

在本发明的一种实施方式，所述基因工程菌为无抗性C.sakazakii BAA894△ESA-02008，以Cronobacter sakazakii BAA894为出发菌、缺失了核苷酸序列为SEQ ID NO:1的ESA-02008基因片段。

在本发明的一种实施方式，所述基因工程菌的构建方法如下：将人工构建的ESA-02008敲除片段电转化入含pKD46质粒的C.sakazakiiBAA894，获得突变株C.sakazakiiBAA894△ESA-02008::kan，再化转入pKD-Cre质粒，通过位点特异性重组敲除卡那霉素抗性基因；去除pKD-Cre(参考文献：Yaning Han,Construction of Monophosphoryl Lipid AProducing Escherichia coli Mutants and Comparison of Immuno-StimulatoryActivities of Their Lipopolysaccharides,Marine Drugs,2013,11,363-376)质粒后获得无抗性lipid A的基因结构突变的基因工程菌。

在本发明的一种实施方式，所述ESA-02008敲除片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

在本发明的一种实施方式，所述位点特异性重组为Cre酶介导的loxP位点特异性重组，最终42℃培养去除pKD-Cre质粒，获得无抗性类脂A的结构基因缺失的基因工程菌。

本发明的第二个目的是提供一种降低Cronobacter sakazakii对阳离子抗菌肽抗性和/或降低Cronobacter sakazakii细胞毒性和/或降低Cronobacter sakazakii菌株在巨噬细胞中的繁殖水平的方法，所述方法是敲除Cronobacter sakazakii菌的ESA-02008基因片段。