[发明专利]构建DNA文库的试剂盒和方法

说明书

本发明提供了构建DNA文库的试剂盒和方法。该试剂盒包括：酶试剂、缓冲液及接头组合，酶试剂包括第一酶混液、T4DNA连接酶及第二酶混液，第一酶混液由T4多聚核酸激酶、T4DNA聚合酶、Klenow片段及rTaq酶混合而成；第二酶混液为2X KAPA HiFi HotStart预混液；缓冲液包括第一缓冲液和第二缓冲液，第一缓冲液由10X T4DNA连接酶缓冲液、dNTP混合液及ATP混合而成；第二缓冲液由ATP、Tris‑HCl、MgCl2、PEG8000、Tween 20及二硫苏糖醇混合而成；接头组合包括接头序列组和标签序列组。该试剂盒能够降低文库构建成本并提高扩增效率。

技术领域

本发明涉及高通量测序文库构建领域，具体而言，涉及一种构建DNA文库的试剂盒和方法。

背景技术

现在通用的小片段DNA文库构建方法主要是采用NEB的建库试剂盒，如Ultra^TM或者DNA Library Prep Kit for Illumina等，这些试剂盒基本上适用于所有的小片段(180bp～500bp)文库的构建，包括不同物种、不同质量或者不同的片段类型的样本。且所构建的文库广泛应用于从头测序(denovo sequencing)或重测序(resequencing)等。

上述试剂盒构建文库的主要流程如下：S1：对基因组进行片段化；S2：片段化DNA的末端不是平末端，因此要对其进行补平(20℃30min)，补平后进行加A(65℃30min)；S3：采用TA连接的方式加上一段固定的序列即U字型接头(20℃15min)，加入USER酶将U字型接头打开(37℃15min)；S4：用AMPure XP磁珠进行片段选择，获得所需的加完接头的目的片段；S5：目的片段进行PCR富集，PCR循环数可以根据模板量进行调节，一般6-15个循环；S6：最后用AMPure XP磁珠纯化PCR产物后即可出库。

但是，现有的NEB建库试剂盒在构建文库时存在下几个方面的缺点：(1)建库成本较高：成品试剂盒价格一般比较贵，单次单一样本的建库成本在200元以上；(2)扩增效率比较低：尤其是样本量比较低的样本，无法进行成功出库；(3)纯化步骤易出错：NEB的建库流程在进行片段选择的时候通常经过2步磁珠纯化(分别去大片段和去小片段的方式)，第1步纯化是留上清溶液去掉吸附在磁珠上的大片段，第2步是去上清去掉小片段，2步磁珠纯化的不同操作容易混淆；(4)磁珠纯化的选择性较差：磁珠选择的片段较宽，过宽的片段中会有较大的片段，较大的片段在后续的PCR和簇生成的过程中处于劣势地位，最后可能导致数据产出不足；(5)实验流程相对繁琐：NEB试剂盒中的接头是U型接头，在加完接头后会增加一步添加USER酶将U型接头变为Y型接头的过程才可进行后续的PCR富集，实验流程相对繁琐。

因此，即使现有的试剂盒在构建文库方面有诸多优势，但仍具有上述诸多缺陷，因而仍旧难以满足市场上对DNA文库构建多样化的需求。

发明内容

本发明的主要目的在于提供一种构建DNA文库的试剂盒和方法，以解决现有技术中的试剂盒扩增效率较低的问题。

为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种构建DNA文库的试剂盒，该试剂盒包括：酶试剂，酶试剂包括第一酶混液、T4 DNA连接酶以及第二酶混液，第一酶混液由T4多聚核酸激酶、T4 DNA聚合酶、Klenow片段以及rTaq酶混合而成；第二酶混液为2XKAPA HiFi HotStart预混液；缓冲液，缓冲液包括第一酶混液所对应的第一缓冲液和T4DNA连接酶所对应的第二缓冲液，第一缓冲液由10X T4 DNA连接酶缓冲液、dNTP混合液以及ATP混合而成；第二缓冲液由ATP、Tris-HCl、MgCl₂、PEG8000、Tween 20以及二硫苏糖醇混合而成；以及接头组合，接头组合包括接头序列组和标签序列组。