[发明专利]一种通过敲除其他代谢途径进而提高反式-4-羟脯氨酸产量的生物合成方法

说明书

技术领域

一种通过敲除其他代谢途径进而提高反式-4-羟脯氨酸产量的生物合成方法，属于微生物基因工程领 域。

背景技术

羟基-L-脯氨酸(简称：羟脯氨酸，Hydroxyproline，Hyp)为亚氨基酸，是L-脯氨酸羟基化后的产物， 根据其羟基化位置的不同，可分为3-羟脯氨酸(3-Hyp)或4-羟脯氨酸(4-Hyp)。羟脯氨酸(Hydroxyproline， Hyp)是胶原蛋白的主要组成成分，不属于20种常见的氨基酸。

近些年来，Hyp的研究和开发已经引起医药、生化、食品及美容业等方面的广泛关注。它可以作为化 妆品添加剂，具有抗氧化、抗辐射的作用；它具有减肥作用，可望成为比较理想的减肥药物；具有多种生 理功能与独特的生物活性，既可作为各种软组织疾病的药物，如结缔组织受损、风湿性关节炎等，又可加 快伤口愈合，以及治疗各种皮肤疾病；作为氨基酸注射液的重要组分，它对急慢性肝病所导致的低蛋白 血症有一定的疗效；它参与脂肪的乳化及红细胞血红素和球蛋白的形成，具有调节脂肪乳化等作用；它还 是多种药物，如第三代抗生素、抗肿瘤、抗高血压及新型胃药等的合成原料。

目前，生产羟脯氨酸的方法有化学合成法、生物组织提取法以及生物合成法。化学合成方法合成步骤 较多，成本高，不适合工业生产。而生物组织提取法利用动物蛋白来源如明胶、猪皮为原料，经酸、碱或 蛋白水解酶水解后提取羟脯氨酸，该法纯化步骤长，成本高，浪费大量原料，且废弃物污染严重，很容易 被市场淘汰。随着DNA重组技术的发展以及微生物资源的发现，生物合成酶法生产羟脯氨酸成为工业上 很有前景的生产方法。

生物合成法能将游离的L-脯氨酸通过脯氨酸羟化酶的催化，转化为羟基-L-脯氨酸，但在生物细胞中， 游离的脯氨酸也是一种可以被利用的碳源，其积累量比较有限，所以有必要切断生物细胞内与L-脯氨酸竞 争前体底物谷氨酸的其他代谢途径，使得L-脯氨酸得到大量积累，进而更多的转化为羟基-L-脯氨酸，提 高羟基-L-脯氨酸产量。

本发明所提供的切断分支代谢途径进而提高提高羟基-L-脯氨酸产量的生物合成方法，具有重要的工业 应用价值。

发明内容

针对生物合成法生产羟基-L-脯氨酸时，需外源添加L-脯氨酸导致生产成本较高的缺点，本发明的目 的是提供一种通过提高底物L-脯氨酸积累量进而提高羟基-L-脯氨酸产量的生物合成方法。

本发明是一种通过提高底物L-脯氨酸积累量进而提高羟基-L-脯氨酸产量的生物合成方法。其特征是： 切断生物细胞内与L-脯氨酸竞争前体底物谷氨酸的其他代谢途径，使得L-脯氨酸得到大量积累，进而更多 的转化为羟基-L-脯氨酸，提高羟基-L-脯氨酸产量。

本发明所述重组细胞的构建方法：

1.含有脯氨酸羟化酶基因的载体的构建

根据大肠杆菌密码子的偏好性，利用密码子的简并性在不改变氨基酸序列的基础上，消除低使用率的 密码子，优化脯氨酸羟化酶基因，使得其更有利于在大肠杆菌中得到表达。同时，选用色氨酸串联启动子 作为其启动子，对其进行优化，使得羟化酶基因得到更为高效的表达。

2.通过敲除基因argB切断生物细胞内与L-脯氨酸竞争前体底物谷氨酸的精氨酸代谢途径

谷氨酸起始的下游代谢主要包括脯氨酸、谷氨酰胺和精氨酸3个途径。在精氨酸合成途径中，三羧酸 循环代谢支路生成的谷氨酸不仅是精氨酸合成的前体，而且还是脯氨酸合成的前体，脯氨酸与精氨酸的合 成形成竞争关系。因此，切断精氨酸合成支路有利于细菌体内代谢流向脯氨酸合成方向。

argB编码的乙酰谷氨酸激酶NAGK是精氨酸生物合成一个关键酶，其受到精氨酸的反馈抑制和反馈 阻遏。乙酰谷氨酸激酶(N-acetyl-L-glutamatekinase，NAGK)是氨基酸激酶家族酶系之一，利用ATP催 化乙酰谷氨酸(N-acetyl-L-glutamate，NAG)的γ-COO群组磷酸化生成无水酰基磷酸盐，且这个过程具 有可逆性。

敲除argB基因，可以有效的打断细胞内由谷氨酸生成精氨酸的途径，从而积累更多的L-脯氨酸，有 利于羟脯氨酸的产生。

3.重组大肠杆菌的发酵实验