[发明专利]一种侯钩藤的分子鉴定方法

说明书

本发明公开了一种侯钩藤的分子鉴定方法。本发明在首次获得侯钩藤的ITS序列（如SEQ ID NO.1所示）的基础上，以待测样品的总DNA为模板，利用引物ITS5和ITS4扩增得到待测植物的rDNA ITS序列；将rDNA ITS序列与SEQ ID NO.1所示序列进行比对分析，具体是找出匹配后的12位、86位、105位、120位、450位、547位或569位的碱基中的至少2个碱基进行比对，根据比对结果鉴定待测样品是否为侯钩藤。上述位点是侯钩藤区分于钩藤属其他种植物的唯一性位点信息，可在分子生物学水平对侯钩藤进行快速、准确的分子鉴定；为中药钩藤的规范用药、安全用药提供了必要保障。

技术领域

本发明属于分子鉴定技术领域。更具体地，涉及一种侯钩藤的分子鉴定方法。

背景技术

侯钩藤(Uncaria rhynchophylloides)是茜草科钩藤属植物，钩藤属植物主要分布于我国贵州、云南、广东、广西等地区，为中医常用药，药用历史悠久。《本草纲目》记载：“钩藤，手、足厥阴药也。足厥阴(肝经)主风，手厥阴(心包经)主火，钩藤通心包于肝木，风静火熄，则诸症自除”。具有息风定惊，清热平肝的功效。化学成分研究表明，钩藤中主要有效成分为生物碱，但不同种钩藤的药效成分有一定的差别。由于钩藤药材的广泛应用，来源比较复杂，且各品种间外形及其相似，加之某些地区的品种濒危，导致市场上出现互混、互代、以次充好的现象，影响了用药的安全性和有效性。

目前，中药钩藤的分类鉴定主要依据形态学、组织学和化学成分分析等传统方法。由于钩藤各品种间的外形及其相似，所以难以从药材外观形态上进行快速准确的鉴定其种类；而且通过根茎的解剖特征和化学成分分析方法亦难以鉴定其基原。因此，需要一种能够对钩藤属植物进行更精确，更快速的鉴定方法。

ITS(Internal Transcribed Spacer)区序列是核糖体转录间隔区序列，在编码核糖体RNA的核糖体DNA上，按照18S、5.8S、28S的顺序纵向排列，而18S和5.8S、5.8S和28S之间的序列就是ITS序列。随着分子生物学和生物信息学的快速发展，应用ITS区序列对药用植物进行种类鉴定和种间分类已逐渐成为中药分类学的研究热点。目前，国内外尚未有侯钩藤(Uncaria rhynchophylloides)分子鉴定的报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有依据形态学、组织学和化学成分分析等传统方法对侯钩藤(Uncaria rhynchophylloides)鉴定的缺陷和不足，提供一种用于侯钩藤鉴定的准确性高而且快速的分子生物学方法。利用钩藤属植物核糖体DNA的ITS区域碱基序列的种特异的多态性，鉴别待测样品是侯钩藤(Uncaria rhynchophylloides)或者不是侯钩藤。

本发明的目的是提供一种侯钩藤的分子鉴定方法。

本发明另一目的是提供上述分子鉴定方法在侯钩藤的鉴定中的应用。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

本发明经过大量的研究实验，得出了侯钩藤的ITS序列，序列如SEQ ID NO.1所示。

上述ITS序列在鉴定侯钩藤(Uncaria rhynchophylloides)方面的应用也在本发明的保护范围之内。

一种侯钩藤的分子鉴定方法，包括如下步骤：

S1.以待测样品的总DNA为模板，利用引物ITS5和ITS4扩增得到待测植物的rDNAITS序列；

S2.将上述rDNA ITS序列与权利要求1中SEQ ID NO.1所示序列进行比对分析，具体是找出匹配后的12位、86位、105位、120位、450位、547位或569位的碱基中的至少2个碱基进行比对，根据比对结果鉴定待测样品是否为侯钩藤(钩藤属植物的ITS的起始部位的序列为5’-TCGAATCCTG)；