[发明专利]一种诱导转基因花生发状根生物反应器产白藜芦醇的方法

说明书

本发明涉及一种诱导转基因花生发状根生物反应器产白藜芦醇的方法，属于生物技术领域。利用发根农杆菌介导将烟草根特异启动子NtR12驱动花生白藜芦醇合酶基因AhRESS载体pBI121‑NtR12‑AhRESS遗传转化花生，获得特异表达AhRESS的转基因花生发状根。建立了高产白藜芦醇的优化生产体系，花生发状根培养至第11天，经20mM的醋酸钠处理24h，发状根中白藜芦醇含量可提高0.8倍，是非转基因花生根系的5.34倍，含量达到148.62μg/g（FW），同时培养基中白藜芦醇为80.86μg/100mL,是花生本身根系白藜芦醇含量的7倍多。本发明为利用生物反应器培养花生发状根进而生产白藜芦醇奠定了基础。

技术领域

本发明涉及一种诱导转基因花生发状根生物反应器产白藜芦醇的方法，属于生物技术领域。

技术背景

白藜芦醇（Resveratrol，简称Res），是一种重要的植物抗毒素，存在于虎杖、葡萄、花生等植物中，在葡萄果皮和花生根中含量尤为丰富。花生具有白藜芦醇的合成能力，花生中白藜芦醇主要分布于花生的根组织。然而，花生的根和根瘤菌存在着互利共生的关系，花生成熟之后的根往往会附着大量根瘤，不利于白藜芦醇的提取纯化。花生生理成熟的后期，经常遇到干旱，导致花生的根和果实受到黄曲霉的污染，因此，这类花生根不能用于白藜芦醇的提取。此外，花生自然根中白藜芦醇的含量相比虎杖和葡萄皮都比较低，提取纯化效率极低，成本增加。

在花生各组织中，白藜芦醇以根中的含量最高。因此，快速获得大量根，既获得了植源性的白藜芦醇材料，进而可以大量提取白藜芦醇。而发根农杆菌可以侵染植物，在伤口处形成发状根，且发状根无激素依赖性，又可以快速生长，在短时间内增长数百倍甚至上千倍。基于此，以发状根液体培养是快速大量生产白藜芦醇的一条捷径。刘杰等研究表明：花生发状根的最适基本液体培养基为无激素的MS培养基，添加植物激素会不同程度的抑制发状根的生长，100 μmol/L 水杨酸（SA）可以提高花生发状根白藜芦醇苷合成分泌以及白藜芦醇的合成。Fabricio等研究发现，花生发状根可以高效产生白藜芦醇，不同生长阶段的发状根诱导产生白藜芦醇含量不同，且在合适的生长阶段，一定浓度的醋酸钠诱导发状根24h，白藜芦醇会被分泌到液体培养基中。以上研究都是用发根农杆菌直接侵染花生产生发状根而进行的研究；对用根特异启动子驱动花生白藜芦醇基因在花生发状根中的大量表达，进而优化研究发状根的白藜芦醇产量的研究未见报道。况且，发状根的生长受很多因素的影响，培养基、培养温度以及机械压力都会影响发状根的生长。已知，发状根的次生代谢产物含量都很低，需要在筛选高含量白藜芦醇发状根系的基础上，优化发状根的液体培养条件，提高发状根的生长速度，通过诱导物的诱导，使白藜芦醇含量大幅提高，为工业大规模利用花生发状根液体悬浮培养大量生产白藜芦醇奠定理论基础。

本发明针对以上研究背景，利用已经获得的转基因花生发状根新材料，经醋酸钠诱导增加花生发状根中白藜芦醇含量，通过发状根液体悬浮培养，快速大量获得发状根。利用有机溶剂浸提法和萃取法分别提取发状根和培养基中的白藜芦醇并进行HPLC检测，本发明可为利用生物反应器规模化培养花生发状根生产白藜芦醇奠定良好的基础。

发明内容

本发明利用烟草根特异表达启动子驱动花生白藜芦醇基因，构建了pBI121-NtR12-AhRESS根特异表达载体，采用多次冻融法把载体导入发根农杆菌，通过农杆菌介导，把融合基因NtR12：AhRESS整合到花生基因组，获得了同时表达发状根基因和AhRESS基因的花生发状根生产系，，在发状根培养的中后期通过加入醋酸钠诱导大大增加花生发状根中白藜芦醇的合成量，通过减少培养基的浓度和数量，提高了悬浮培养条件快速大量获得发状根。利用有机溶剂浸提法和萃取法分别提取发状根和培养基中的白藜芦醇并进行HPLC检测。本发明可为利用生物反应器规模化培养花生发状根生产白藜芦醇奠定良好的基础。

本发明提供了一种诱导转基因花生发状根生物反应器产白藜芦醇的方法。目的在于建立一种诱导转基因花生发状根生物反应器，并利用该反应器大量生产白藜芦醇的技术。以便利用生物反应器规模化培养花生发状根进而大量生产白藜芦醇。