[发明专利]一种基于荧光共振能量转移技术的G蛋白偶联受体40筛选模型

说明书

技术领域

本发明属于药理学领域，利用荧光检测技术，构建了稳转细胞株脂肪酸受体GPR40激动剂药物筛选模型，用于待测样品对稳转细胞株脂肪酸受体GPR40激动剂活性的高通量检测。

背景技术

脂肪酸受体GPR40是G蛋白偶联受体家族成员之一，主要与G蛋白q亚型和s亚型偶联发挥作用。GPR40人类肝脏、心脏、骨骼肌、胰腺和脑等组织中都有表达。GPR40通过激活多条细胞内信号途径发挥不同的生物学功能，在调节胰岛素分泌，引起胰岛B细胞过度增殖等过程中具有重要作用。所以建立GPR40激动剂筛选模型对治疗糖尿病等疾病具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于建立一种基于荧光的稳转细胞株脂肪酸受体GPR40激动剂高通量筛选模型，具有信噪比高，使用安全，样品消耗量小的特点。

本发明的技术方案：采用荧光方法建立稳转细胞株脂肪酸受体GPR40激动剂药物高通量筛选模型，通过该模型验证Oleicacid对GPR40的激动作用。具体步骤如下：

本发明利用荧光的方法建立了稳转细胞株脂肪酸受体GPR40激动剂药物高通量筛选模型。

步骤一：稳转细胞株脂肪酸受体GPR40激动剂筛选模型的建立与优化。

步骤二：阳性药验证模型可靠性。

步骤三：高通量筛选模型验证。

附图说明

图1：IP1标准曲线

图2：Oleicacid刺激cAMP产生的量效关系

图3：Oleicacid刺激cAMP产生的量效关系

图4：Oleicacid刺激cAMP产生的量效关系

图5：激动剂验证结果

具体实施方式

以下结合附图说明本发明的具体实施方式：

一、稳转细胞株脂肪酸受体GPR40激动剂剂筛选方法建立

1、实验材料

(1)细胞株：CHOGPR40。

(2)完全培养：DMEM；10％FBS；200ug/mlZeocin，100ug/mlHygromycin。

(3)主要仪器：CO₂培养箱；384孔板；Paradigm^TMDetectionPlatform。

2、实验步骤

(1)细胞培养

1)T25中培养的细胞贴壁度要达到80％，达到对数生长期。

2)弃去培养基后用1mLPBS冲洗细胞一次。

3)用3mL0.5mMEDTA消化细胞5min后用3mL培养基终止消化。

4)1000rpm离心5min。

5)弃去上清液后用适量培养基重悬细胞，对细胞计数。

6)用培养基稀释细胞悬液至6mL，使细胞密度达到7.5×10⁵cells/mL，将此细胞悬液移入T25培养瓶中，在37℃/5％CO₂环境下培养细胞。

7)用于确定细胞数、验证阳性药及筛选GPR40激动剂试验的CHOGPR40细胞应是复苏后至少传代3次且达到稳定生长状态的细胞。于实验前将其用PBS润洗细胞一次，接着用0.5mMEDTA消化，离心，去除上层液体，最后将细胞用适量IP1stimulation重悬至所需细胞密度。

(2)标准曲线的测定及最佳细胞数确定

1)配制IP1标准稀释液：IP1标准溶液(试剂盒自带)逐级稀释。

2)配制Oleicacid梯度稀释液：需要用Oleicacid对细胞进行刺激，所以应将Oleicacid

储备液逐级稀释。

3)配制不同浓度的细胞稀释液：用IP1stimulationbuffer将1.(7)中重悬好的细胞分别稀释为30000cells/well、15000cells/well及7500cells/well。