[发明专利]一种H7N9亚型禽流感病毒检测试剂盒及其使用方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种分型检测H7N9亚型禽流感病毒核酸的RT-PCR-ELISA试剂 盒及其使用方法。

背景技术

甲型流感病毒分类上属于正粘病毒科，基因组由8个单链负义RNA节段组成。甲型流感病毒宿主较 广，可以感染人、禽和其它哺乳动物。根据病毒表面2个糖蛋白血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)的抗原 性，甲型流感病毒可以分为不同的血清亚型。目前已在甲型流感病毒的自然储存宿主野生水禽中发现16 种HA亚型(H1-H16)和9种NA亚型(N1-N9)。一般情况下，禽流感病毒不会突破种属障碍感染人。 但自1997年香港H5N1禽流感病毒感染人事件以来，禽流感病毒(包括H5、H9和H7亚型)感染人事件 的发生越来越频繁。2013年初，在我国长三角地区出现一种新的通过基因重配产生的H7N9亚型禽流感病 毒，该病毒能够跨物种感染人并引起严重疾病。目前中国大陆的省份和地区都有病例报道，截止，对 人类健康和公共卫生造成新的重大威胁。

目前针对H7N9亚型禽流感病毒感染的核酸检测方法主要有基因测序法、Real-timetimePCR法和环等 温扩增(LAMP)法等。基因测序法是分子诊断的金标准，但耗时费力，一般需要24-48小时，对实验人 员的技术要求高，同时试验仪器和试剂昂贵，一般实验室难以开展。Real-timetimePCR法和LAMP法具 有很好的特异性和敏感性，但前者同样依赖昂贵的仪器和试剂；而后者难以实现多重检测。因此，建立一 种成本低、通量高、适合现场诊断的H7N9亚型核酸分子检测方法，对于疾病的临床救治和防控意义重大。

发明内容

本发明需要解决的问题是提供一种分型检测H7N9亚型禽流感病毒核酸的多重PCR-ELISA试剂盒及 其使用方法。

本发明提供的检测H7N9亚型禽流感病毒核酸的多重PCR-ELISA的试剂盒由RT-PCR反应体系；3个 靶基因甲型流感病毒M基因、H7N9亚型病毒HA基因和H7N9亚型病毒N9基因的阳性质粒：pMD-M、 Pmd-H7和Pmd-N9；阴性质控品和3个靶基因的特异性引物探针(表1)组成，探针的5端用生物素(BIctO) 标记。

表1靶基因的特异性引物探针

本发明所述一种多重PCR-ELISA试剂盒在H7N9亚型禽流感病毒分型检测中的使用方法：

(1)病毒核酸提取：采用常规方法提取临床鼻咽拭子标本或病毒培养物核酸，-70℃冰箱放置备用。

(2)多重PRT-PCR反应：采用TaKaRa公司的一步法试剂盒进行PCR扩增反应，反应体系为：10× ExTaqBuffer4μL，25mMMgCl5μL，2.5mMdNTPs6μL，TaqDNA聚合酶5U，M、H7和N9上下游 引物各0.75μL，模板1.6μL，加DEPC水至50μL.。扩增程序为：50℃逆转录30min，94预变性2min， 热循环参数为94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸90s，35个循环后，72℃延伸7min，得到生物素标 记的PCR产物，同时设置空白对照组。

(3)ELISA检测:取扩增好的生物素标记的PCR产物5μL，加至10μL的0.1mol/LNaOH溶液中， 于室温下变性10min，再加入10nmol/L地高辛标记的特异性探针(用含有300mmol/LNaCl，100mmol/L Tris-HClpH6.5，10mmol/LEDTA，0.1％Twee-20的杂交液稀释)，50℃孵育10min。随后，取100μL液体 加至链霉亲和素包被的96孔微板中，50℃孵育60min，弃去孔中液体，加入300μLPBST洗板5次。然 后加入辣根过氧化物酶标记的抗地高辛抗体100μL，37℃孵育60min，洗板5次，最后加入TMB显色液 进行显色，一定时间后加入终止液终止显色，于酶标仪450nm波长处测定其吸光度值(OD)。本实验需设 置两个或两个以上重复，同时以PCR扩增反应中的空白对照作为阴性对照组，若实验组的OD值>2倍阴 性对照组平均OD值，则判定为阳性，反之则为阴性。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：。