[发明专利]一种肺癌辐射抗性细胞株的构建方法

说明书

技术领域

本发明属于细胞生物学领域，具体地说是涉及一种具有稳定辐射抗性的肺癌辐射抗性细胞株的构建方法。

背景技术

肺癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，2014年国家癌症中心发布《中国肿瘤登记年报》报道，肺癌在我国恶性肿瘤中发病率居第一位，每年新发病例约60万，死亡病例约49万。放射治疗是目前肺癌多学科综合治疗的重要手段之一，统计显示超过70％的患者在诊疗过程中要接受放射治疗。然而，虽经各种手段综合治疗，肺癌疗效总体差强人意，5年生存率长期徘徊于15％左右，亟待改善。肿瘤复发和转移是肺癌放射治疗失败的主要原因，现有研究认为，肺癌放射治疗后残留细胞，即肺癌辐射抗性细胞侵袭力和转移活性增强，是肿瘤复发和转移的根源。因此，构建肺癌辐射抗性细胞体外模型，对提高肺癌治疗疗效具有重要意义。

目前用于构建肺癌辐射抗性细胞的方法主要有小剂量等分割照射法和亚致死剂量照射法，其中小剂量等分割照射法因照射次数较多、构建周期需一年以上，细胞污染几率大，稳定传代成系较难。亚致死剂量照射法是采用使肺癌细胞DNA单链断裂的亚致死剂量1次性照射，例如分别给予肺癌A549和H1299细胞亚致死剂量6.5Gy和5.5Gy的1次性照射。但目前临床常规剂量分割放射治疗总剂量应不低于60Gy，亚致死剂量照射法与现有临床放疗模式相差较大，因此采用此法构建的肺癌辐射抗性细胞无法最大限度模拟临床复发癌放射生物学特性。

发明内容

本发明的目的是提供一种具有稳定辐射抗性的肺癌辐射抗性细胞株的构建方法，照射次数少，构建周期短，细胞污染几率小，构建的辐射抗性细胞株能模拟临床复发癌放射生物学特性。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一种肺癌辐射抗性细胞株的构建方法，包括以下步骤：

①将肺癌细胞置于37℃、5％CO₂培养箱内常规培养，当其覆盖培养瓶60～70％并处于对数生长期时，接种于六孔板中，把六孔板置于照射野中心，六孔板底面覆盖1.5cm厚的组织等效填充物，照射源为医用直线加速器，6MV-X线，机架旋转180°，在室温条件下射线从下方垂直入射，剂量率300cGy/min，源皮距SSD＝100cm，第1次予以2Gy照射；

②照射后更换新鲜培养基，待细胞覆盖培养瓶80％以上时，胰酶消化，传代两次以上；

③传代后置于37℃、5％CO₂培养箱内培养2～3天，待细胞再次覆盖培养瓶60～70％后，再次给予2Gy照射；

④每一次照射后的细胞均按上述步骤②和步骤③的方法传代并培养至稳定状态后再进行照射，依次增加照射剂量达4Gy、6Gy、8Gy和10Gy，每剂量均照射2次，总剂量达60Gy，继续培养及传代5代以上至细胞形态、增殖稳定，冻存备用。

进一步，所述六孔板中每孔细胞接种量为5×10⁵个。

进一步，所述医用直线加速器为Varian 23-EX医用直线加速器。

进一步，所述X线的照射野大小为30cm×30cm。

本发明的技术方案有如下有益效果：

1、利用本发明构建肺癌辐射抗性细胞株，总共进行射线照射10次，照射次数少；构建周期约6个月，时间短；且因细胞从细胞无菌培养室外置于放射治疗室的次数较少，细胞污染几率小，优于小剂量等分割照射法；

2、集落形成实验是目前国际公认的检测细胞辐射抗性的金标准。本发明采用集落形成实验检测细胞的辐射抗性，结果表明采用本发明构建的肺癌辐射抗性细胞株的平均致死量D₀、准阈剂量Dq和2Gy生存分数SF₂均高于亚致死剂量照射法，即采用本发明构建肺癌辐射抗性细胞株的辐射抗性高于亚致死剂量照射法；

3、本发明照射总剂量为60Gy，与现有临床放疗模式相近，构建的辐射抗性细胞株能最大限度模拟临床复发癌放射生物学特性。

附图说明

图1为本发明构建方法的流程图；

图2为A549细胞与辐射抗性A549R细胞在倒置光学相差显微镜(100倍放大)下的形态图，其中，A为A549细胞形态图，B为A549R细胞形态图；

图3为集落形成实验绘制的A549与辐射抗性细胞的细胞生存曲线图，其中A为单靶多击模型，B为二次线性模型；

图4为H1299细胞与辐射抗性H1299R细胞在倒置光学相差显微镜(100倍放大)下的形态图，其中，C为H1299细胞形态图，D为H1299R细胞形态图；