[发明专利]cry1Ia基因及应用、由其编码的Cry1Ia蛋白及制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及cry1Ia基因及其应用，由cry1Ia基因的编码的Cry1Ia蛋白和编码蛋白在寄生线虫防治上的应用。

背景技术

植物寄生线虫病是农作物的重要病害之一。全球每年由植物寄生线虫所造成的作物损失超过千亿美元(Chiwold，2003)，线虫病害已成为农业生产上的一个突出问题。目前，农业生产上常采用化学杀线虫剂来防治植物寄生线虫病害，但现今市场上杀线虫剂的品种有限，大部分为高毒、高残留农药，长期单一地使用高毒、高残留的化学杀线虫剂，不仅对环境造成了严重的污染，也引发了农产品中农药残留超标、线虫抗药性日益突出等系列环境和社会问题。近年来，随着人们对农产品安全的日益关注，化学农药的使用越来越受到限制，因此，研发有效的杀线虫微生物以补充或替代化学杀线虫剂就显得日益迫切。

苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis，简称Bt)是目前世界上应用最广泛、最成功的微生物杀虫剂，被广泛应用于农业、林业、贮藏以及卫生等领域的害虫防治。自从1961年Ciordia等首次发现Bt对牛肠道蛇形毛圆线虫(thichostrongylus colubriformis)卵和幼虫有杀灭作用以来，Bt的杀线虫作用才逐渐引起人们的关注。国内外已报道的具有杀线虫活性的Bt菌株主要包括Bt苏云金亚种(B.t.subsp.thuringiensis)、以色列亚种(B.t.subsp.Israelensis)、库斯塔克亚种(B.t.subsp.Kurstaki)和莫里斯亚种(B.t.subsp.Morris)。这些菌株对多种植物线虫具有生物活性，如酸酱线虫(Panagrellus redivivus)、南方根结线虫(Meloidogyne incognita)、穿刺短体线虫(Pratylenchus penetrans)和大豆孢囊线虫(Heterodera glycines)等(Schnepf，1998)。

1985年Bone等首次证实了Bt伴胞晶体蛋白(δ-内毒素)对线虫的作用活性，2003年Wei等研究了不同基因产生的伴胞晶体蛋白对几种自由生活线虫的毒性，从两个主要的B.t.晶体蛋白亚家族中表达出了7种不同的晶体毒素蛋白，通过测试这些晶体毒素蛋白对自由生活的线虫毒性，证实了其中4种晶体毒素蛋白(Cry5B、Cry6A、Cryl4A、Cry21A)对多种线虫种类均有活性，所测试的线虫至少对一种晶体毒素蛋白敏感，从而明确提出Bt晶体毒素蛋白具有杀线虫能力(Wei JZ,2003)。B.t.晶体毒素蛋白是由毒素蛋白基因(cry基因)编码的，不同苏云金芽胞杆菌亚种或菌株所具有的cry基因不同。1988年以来，美国Mycogen公司分离到一些对秀丽新小杆线虫、短体线虫、捻转血矛线虫等有毒性的苏云金芽胞杆菌，并从这些菌株中克隆了一些杀线虫毒素蛋白基因(参见http://appft.uspto.gov/netacgi)。到目前为止，全世界从B.t.菌株中已分离到的杀线虫基因主要有cry1、cry5、cry6、cry12、cry13、cry14以及cry21几大类，但数量十分有限，而且这些菌株、伴胞晶体蛋白及伴胞晶体蛋白基因几乎都以专利的形式加以保护，所涉及的菌株也多使用代号。因此，分离鉴定新的杀线虫Bt菌株与伴胞晶体蛋白引起国内外科学家的广泛重视。

cry1Ia基因是cry基因家族中非常特殊的cry1类基因，最先由Tailor等从B.thuringiensis菌株4835中克隆，该基因编码一个81KD的蛋白，对鳞翅目的夜蛾科(Noctuidae)、卷叶蛾科(Tortricidae)、菜蛾科(Plutellidae)和鞘翅目的叶甲科(Chrysomelidae)的害虫具有较好的杀灭效果。cry1Ia基因在大都数Bt菌株中被沉默而没有表达产物((Kostichka et a1,1996)，其主要原因在cry1I基因编码区上游一般与cryl类基因相邻，称为cryl-crylI连锁，造成了crylI基因自身启动子的缺乏。

尽管cry1Ia基因在Bt菌株中普遍被沉默，但已有多个基因被克隆，全球分离克隆的cry1Ia基因有13种。但是目前为止，克隆获得的cry1Ia基因及表达蛋白的杀虫作用仅限于鳞翅目和鞘翅目害虫，还没有cry1Ia基因及表达产物对植物寄生线虫具有作用活性的相关研究报道。