[发明专利]一种耐高温海藻糖合酶及其表达基因与应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种耐高温海藻糖合酶及其表达基因与应用，特别涉及一种恶臭假单胞菌海藻糖合酶经过定向改造后获得的耐高温海藻糖合酶及其表达基因与应用，属于生物技术技术领域。

背景技术

海藻糖(Trehalose)是一种由两个吡喃环葡萄糖分子经α-1,1-糖苷键连接构成的非还原性二糖，广泛存在于细菌、酵母、丝状真菌、植物、昆虫、无脊椎动物等生物体体内。研究表明，其性质稳定，对生物体具有非常重要的生物学意义。主要表现在它是生物体能源和碳源的储备物，是蛋白质和生物膜分子在脱水、高温、氧自由基、低温等恶劣环境中的稳定剂和保护剂，是信号传感复合物和生长调控因子，而且还是某些细菌细胞壁的组分之一，因此在科学界海藻糖有“生命之糖”的美誉。海藻糖对生物体具有神奇的保护作用，是因为海藻糖在高温、高寒、高渗透压及干燥失水等恶劣环境条件下在细胞表面能形成独特的保护膜，有效地保护蛋白质分子不变性失活，从而维持生命体的生命过程和生物特征。这一独特的功能特性，使得海藻糖除了可以作为蛋白质药物、酶、疫苗和其他生物制品的优良活性保护剂以外，还是保持细胞活性、保湿类化妆品的重要成分，更可作为防止食品劣化、保持食品新鲜风味、提升食品品质的独特食品配料。因此海藻糖可广泛的应用到医药、化妆品业以及食品行业，具有诱人的开发应用前景和巨大的经济效益。

鉴于海藻糖广泛而重要的应用价值，寻找海藻糖高效方便、低成本生产方法的研究被广泛重视。目前海藻糖的生产方法主要有酵母提取法、发酵法、酶合成法。其中酶法生产海藻糖具有较高的特异性和快速温和等特点，已经成为研发海藻糖工业化生产的热点并作为短期可见效的可行性途径之一。

海藻糖合酶(EC5.4.99.16,Trehalose synthase,TreS)是一种分子内葡糖苷转移酶它只需要一步反应就可以将麦芽糖的α-1,4糖苷键转化为α-1,1糖苷键生成海藻糖。该酶反应流程短，易调控，不需要消耗高能物质，不需要磷酸盐共存，只需要一种酶一步反应就能获得海藻糖，因此海藻糖合酶转化法是适宜工业化生产海藻糖的方法，有着良好的应用前景，受到广泛的关注。到目前为止，国内外有报道的能够产海藻糖合酶的微生物已经超过15种。不同微生物来源的海藻糖合酶的催化效率、酶学性质各有不同，但具有基本共同点：一是底物转化率较低，最高只有80％左右，一般为60％-70％；二是酶的热稳定性较差，最适反应温度为25℃左右；三是反应时间太长，一般为48小时，有的长达72h。

发明内容

针对现有技术的不足，提供一种耐高温海藻糖合酶及其表达基因与应用，耐高温海藻糖合酶为通过对恶臭假单胞菌海藻糖合酶进行定向改造后获得。

本发明技术方案如下：

一种耐高温海藻糖合酶的表达基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

一种耐高温海藻糖合酶，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

该耐高温海藻糖合酶在现有恶臭假单胞菌海藻糖合酶的基础上，根据模拟三维结构，通过分子生物学手段将N端和C端蛋白质柔性区域进行截取，保留蛋白质稳定结构域N42-C680得到。改造后的海藻糖合酶通过大肠杆菌原核高效表达后，利用亲和层析，离子交换层析，分子筛层析等一系列纯化手段，最终获得。该海藻糖合酶与原始的海藻糖合酶(KT2440)相比其表达量有所提高，热稳定性也明显提高。

一种重组载体，在质粒中插入上述SEQ ID No.1所示核苷酸序列。

根据本发明优选的，所述质粒为pET-15b载体质粒。

一种转基因细胞系，宿主细胞内转化有上述重组载体。

根据本发明优选的，所述宿主细胞为大肠杆菌BL21DE(3)。

上述改造后海藻糖合酶的表达基因、重组载体或转基因细胞系在制备海藻糖合酶中的应用。

上述海藻糖合酶在制备海藻糖中的应用。

本发明所述的海藻糖合酶，由恶臭假单胞菌海藻糖合酶(Pseudomonas putida KT2440)经过分子改造获得。具体方法为：根据恶臭假单胞菌海藻糖合酶三维结构模拟，利用PCR的方法，设计引物将其三维结构中的柔性区进行截取，获得海藻糖合酶稳定结构域的基因。将该基因连接到pET-15b载体上构建成质粒，并转化到大肠杆菌BL21DE(3)中进行原核表达。然后通过镍柱亲和层析，Source-Q离子交换层析，Superdex-200分子筛层析的方法分离获得高纯度的海藻糖合酶。

有益效果