[发明专利]一种鉴别5种啮齿动物螺杆菌的PCR-HRM引物和方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种细菌的研究方法，具体涉及啮齿动物螺杆菌的研究方法。

背景技术

啮齿动物螺杆菌(RodentHelicobacter)属于螺杆菌属细菌，大小约为（3.5～5.00）μm×（0.5～0.6）μm，呈螺杆形或弯曲状，不形成芽孢，两极有鞭毛。螺杆菌培养条件苛刻，需要微需氧环境（80～90%NO₂，5～10%O₂和5%～10%CO₂混合气体），而且对培养基营养要求高。至1980年以来，已有30多种螺杆菌被正式命名，根据其定居部位可分为胃内螺杆菌与肝肠螺杆菌；啮齿动物螺杆菌属于肝肠螺杆菌，主要定植于盲肠、结肠以及肝胆管系统。世界各国及国际实验动物理事会已将该类螺杆菌列为啮齿实验动物必须排除的病原微生物，但我国由于缺乏模式菌株和有效的检测方法，还未列入实验动物质量国家标准。

此类菌主要以隐性感染形式普遍存在于大鼠、小鼠、沙鼠等啮齿动物的消化系统，可引起宿主不同程度的病理反应从而导致盲肠结肠炎、肝炎、胆囊炎等各种组织炎症甚至恶性肿瘤的发生。模型动物感染螺杆菌时，可引起诱发一些并发疾病，严重影响实验动物质量并对实验数据的可靠性产生潜在的干扰。

目前，啮齿动物螺杆菌感染的检测方法主要有病原学、血清学及分子生物学方法：

（1）细菌分离培养：取粪便沉淀或肠壁粘液，在特殊的培养基和微氧环境下培养分离该菌。本方法检测成本较高实验周期长，需要培养5～7d，生化鉴定试验操作繁琐，耗时费力，检测周期一般为3～4周。

（2）血清学检测：运用ELISA方法来检测血清或粪便中抗螺杆菌特异性抗体。免疫学方法操作简便，可在同一时间内检测大量样品，但由于交叉反应的存在，使得难以鉴别有些螺杆菌种特异性。

（3）PCR检测：PCR法被认为是检测螺杆菌最有效的方法，已被大量运用。所报道的PCR检测方法包括普通PCR、多重PCR、巢氏PCR、荧光定量PCR等。通常针对16SrRNA序列及各型螺杆菌特异蛋白基因进行引物设计，直接检测粪便、肠内容物及肝组织中该菌体的DNA。关于不同啮齿动物螺杆菌分型的报道较少，

鉴别方法如多重PCR，PCR结合限制性酶切等不同程度存在灵敏度不高、操作较繁琐等缺点。

实验大小鼠是实验动物中使用非常广泛及数量颇多的动物，螺杆菌的感染可对实验数据的可靠性产生严重的干扰。基于目前的各种检测方法，还需要一种操作相对简易、检测结果可靠且检测成本低廉的实验动物螺杆菌分型方法用于实际使用实验动物时螺杆菌的快速筛查。

高分辨率熔解曲线(highresolutionmelting，HRM)是2003年美国Utah大学Wittwer实验室提出的一项用于基因突变检测和基因分型的新技术。近年来随着附带HRM检测功能的real-timePCR仪的普及，HRM基因分型技术在分子诊断领域受到普遍的关注，动物基因和动物病原基因检测技术也得到了一定的发展。

发明内容

本发明目的在于提供一种鉴别5种啮齿动物螺杆菌的PCR-HRM引物。

本发明的另一目的在于提供一种鉴别5种啮齿动物螺杆菌的PCR-HRM方法。

本发明所采取的技术方案是：

一种鉴别5种啮齿动物螺杆菌的PCR-HRM引物，其核苷酸序列如下所示：

F1:5'-CTATGACGGGTATCCGGC-3'（SEQIDNO：1），

R1:5'-CGATTACTAGCGATTCCAGC-3'（SEQIDNO：2）；

F2：5'-GAACCTTACCTAGGCTTGACATT-3'（SEQIDNO：3），

R2：5'-TTAACCCAACATCTCACGACAC-3'（SEQIDNO：4）。

一种鉴别5种啮齿动物螺杆菌的PCR-HRM方法，包括以下步骤：

1）从样品中提取螺杆菌DNA；

2）以DNA为模板，用上述所述的引物对F1和R1进行预扩增反应获得预扩增产物；

3）以预扩增产物作为DNA模板，用上述所述的引物对F2、R2和荧光饱和染料进行PCR-HRM扩增反应获得扩增产物；

4）对扩增产物进行HRM分析，确定螺杆菌类型。

进一步的，上述步骤2）中的PCR预扩增反应体系为：

PreMixrTaq10μL

10μM引物F11μL

10μM引物R11μL

模板1μL

ddH₂O7μL。