[发明专利]CIK细胞培养方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物科学技术领域，尤其是一种CIK细胞培养方法。

背景技术

随着肿瘤免疫学的发展，越来越多的研究表明，杀伤细胞过继免疫治疗对于消除残留的肿瘤病灶、促进患者免疫系统的重建具有良好的效果，并逐步成为化学治疗和造血干细胞移植后清除残留肿瘤细胞的重要治疗手段。CIK 细胞是 1991 年 schmidt wolf 等报道的一类由多种细胞因子诱导的杀伤免疫活性细胞CIK 细胞表面同时表达有 CD3+分子和 CD56+分子，所以兼有T 淋巴细胞较强大的抗肿瘤活性和自然杀伤细胞的非主要组织相容性复合物限制性（MHC）杀瘤优点，其效应细胞为 CD3+CD56+细胞，是具有不同特异性的T 细胞受体的异质群体，具有非 MHC 限制的溶细胞活性对肿瘤细胞。

CIK细胞是一群来源于血液T细胞的异质性细胞群体，通过穿孔素和颗粒酶介导的细胞毒作用和增强IL-12、IFN-γ等细胞因子的作用来杀伤肿瘤细胞。

于1991年建立的由IL-1、IL-2、IFN-γ、Anti-CD3Ab等细胞因子组成的“经典”的CIK扩增方案目前已被全球众多的研究者所采纳。近年以此为基础，一些其他的细胞因子也开始被尝试用于扩增CIK细胞，如Anti-CD28、IL-15、IL-24、SCF、FLT3L等。

白细胞介素 15（IL-15）的生物学作用与 IL-2 相似，是维持和促进效应 T 淋巴细胞的增殖的细胞因子，研究总结了 IL-15 生物学特性：诱导 T、B 和自然杀伤（NK）细胞的分化和增殖；增强 CD8+T 细胞的细胞溶解活性；诱导产生持久的抗原刺激 CD8+ CD44hi 记忆性 T 细胞；刺激 B 细胞的分化和免疫球蛋白的合成；诱导树突状细胞的成熟，但无刺激免疫调节性 T 细胞（Treg 细胞）活性。另有研究表明，IL-15 在机体内自身也具有强大的抗肿瘤作用，而不需要通过 NK 细胞和 CD8+细胞介导。

IL-21 是 IL-2 细胞因子家族最新发现的成员，分子结构与 IL-15 相似，参与调节 B 细胞增殖，协同 IL-15 促进骨髓前体细胞增殖和 NK 细胞增殖、分化和细胞毒活性，由活化的 CD4+T 细胞分泌，利用携带 IL-21 基因的慢病毒转染至 CIKs 细胞内，可以增加 CIK 细胞 IL-21R、穿孔素、颗粒酶 B、FasL、IFN-γ及 TNF-α 的分泌及表达，主要是激活 JAK-STAT 信号转导途径来提高 CIK 细胞的抗白血病活性。

发明内容

本发明的目的是：提供一种CIK细胞培养方法，它的细胞扩增比例高，成本低廉，稳定性好。

本发明是这样实现的：CIK细胞培养方法，从已经取得的外周血100ml中，用生理盐水悬浮的方式分离出单个核细胞，并种植于T75培养瓶中，加入20mlAIM-V培养基，再加1000u/ml IFN-γ，在体积浓度为5%的CO2，37℃下的恒温培养箱培养24小时；再加 100ng/ml 单克隆抗体 CD3及500u/ml IL-2 ，继续培养3-5天；每隔 2 天补加 500u/ml IL-2，同时加50ng/ml 的 IL-15，或加 100ng/ml 的 IL-21，或加25ng/ml 的IL-15 及50ng/ml 的 IL-21；扩增至第 10 天收获 CIK 细胞。

所述的培养过程中，每隔2天倍加换液，半量种入新T175培养瓶中，并全量补充上述细胞因子。

由于采用了以上技术方案，本发明采用新因子体系进行CIK细胞培养，细胞扩增比例超过使用传统扩增方法所获得的比例，且因子的使用量较小，降低了细胞培养成本，增加了培养效果的稳定性。本发明简单易行，成本低廉，使用效果好。

附图说明，

图 1不同细胞因子对外周血 T 淋巴细胞增殖作用，

具体实施方式，

本发明的实施例1：CIK细胞培养方法，

1、分离外周血单个核细胞（PBMC），