[发明专利]λ‑卡拉胶寡糖在制备抗狂犬病毒药物中的用途

说明书

技术领域

本发明涉及λ-卡拉胶寡糖的药物新用途，尤其是在制备抗狂犬病毒药物中的新用途。

背景技术

狂犬病是最古老的传染病之一，是由狂犬病毒(Rabies virus，RABV)引起的一种人畜共患传染病。狂犬病是迄今为止人类病死率最高的急性传染病，一旦发病，病死率几乎达100％。据世界卫生组织(WHO)报告，全世界每年有约55000人死于狂犬病，其中绝大多数分布在非洲和亚洲。近些年，我国平均每年约有3000人左右死于狂犬病，多数发生在广大农村地区或是城乡结合部，主要是由带毒动物咬伤而被感染。RABV随唾液进入咬伤部位，在肌肉中短暂孵育后进入最近的神经纤维，并逐渐向脑移行，伤口部位离大脑越近，其发病也越快。一旦进入神经系统，RABV复制和迁移将不易干涉。暴露后处置(PEP)是预防和控制狂犬病的最有效途径，根据咬伤的程度，通常采用三种手段：1)采用0.1％的肥皂水冲洗创口；2)用抗RABV免疫球蛋白注射创口，中和伤口部位的病毒；3)紧急免疫4-5针狂犬疫苗。目前，许多人只重视免疫狂犬病疫苗，忽略了创口的处理，使RABV在疫苗免疫产生足够的中和抗体之前(通常需要2-4周)潜入大脑，造成免疫失败。由于抗RABV免疫球蛋白价格高昂，难以广泛用于创口的处理，而且需要到一定规模的医疗机构才能接受抗RABV免疫球蛋白处理，难以在咬伤后的第一时间处理伤口。因此，迫切需要开发一种能够在创口部位有效抑制RABV，并且价格低廉，能够广泛应用于广大医疗欠发达地区的药物。

λ-卡拉胶是一种从海洋红藻(诸如角叉菜、杉藻、麒麟菜)中提取得到的水溶性多糖，其结构具有重复的α-(1-4)-D-半乳吡喃糖-β-(1-3)-D-半乳吡喃糖二糖单元骨架，骨架上的多个位置取代有硫酸基团，其降解产物λ-卡拉胶寡糖的化学结构式如下。λ-卡拉胶寡糖有抗凝血、抗病毒(如疱疹病毒)、抗肿瘤等多种生物活性，但是，目前还没有抗狂犬病毒的相关文献报导。

发明内容

本发明发现λ-卡拉胶寡糖能够在体外有效抑制RABV，且具有较长的有效作用时间。故可将λ-卡拉胶寡糖作为外敷或清洗药物用于清除咬伤部位的狂犬病毒，代替价格高昂的抗RABV免疫球蛋白。

经细胞实验表明λ-卡拉胶寡糖细胞毒性弱，如图1所示，即使在细胞培养基中添加1000ug/ml的λ-卡拉胶寡糖，通过MTS分析表明细胞活性无显著下降。同时我们还发现λ-卡拉胶寡糖在多种细胞，如SK-N-SH细胞(人神经瘤细胞)、NA细胞(小鼠神经瘤细胞)和HEK-293T细胞(人胚胎肾细胞)中均能够显著抑制狂犬病毒的增殖，表明药物的作用具有广泛性，而不是细胞特异性的(如图2所示)。

同时我们检测了药物对多个RABV毒株的抑制作用，包括实验室毒株SAD和CVS-B2c株，以及分离于病犬的野毒安徽株，结果表明采用250ug/ml以上浓度的λ-卡拉胶寡糖，均不能在细胞上清中检测到上述三种病毒，表明λ-卡拉胶寡糖能够高效抑制多种毒株的RABV(如图3所示)。

进一步的研究表明：λ-卡拉胶寡糖对RABV的抑制作用发生在病毒入侵细胞的多个阶段，包括病毒对细胞的吸附阶段、病毒进入细胞之后的融合阶段，以及病毒在细胞质中的转录与翻译阶段(如图4所示)。其中，对病毒吸附细胞的影响较小(病毒滴度仅下降10倍)，不影响到病毒吸附后的内吞(如图5所示)，但是显著影响到病毒糖蛋白介导的膜融合过程，从而影响到病毒的脱壳(如图6所示)。此外，λ-卡拉胶寡糖对病毒脱壳后的复制也有一定的抑制作用。

我们还进一步测试了病毒在进入细胞之后λ-卡拉胶寡糖的有效作用时间，分别在病毒进入细胞之后的0、6、12和24小时检测细胞上清中的病毒滴度，发现随着感染后时间的延续，药物对病毒的清除能力逐渐下降，但是在12小时之后，药物仍然对RABV有显著的抑制作用(如图7所示)。

鉴于λ-卡拉胶寡糖与肝素和硫酸乙酰肝素有着类似的结构，我们检测肝素和硫酸乙酰肝素是否也能够抑制RABV。通过在病毒感染细胞的各个阶段中分别添加一定浓度的肝素和硫酸乙酰肝素，如图8所示，结果发现λ-卡拉胶寡糖、肝素和硫酸乙酰肝素在病毒的吸附阶段均对RABV有较弱的抑制作用，但在病毒吸附后阶段，肝素和硫酸乙酰肝素远没有λ-卡拉胶寡糖抑制病毒的能力强大。