[发明专利]外源性基因表达载体、转化体判断标记物以及转化体

说明书

技术领域

本发明涉及一种外源性基因表达载体，利用其的转化体判断标记物以及将它们导入的转化体，其中，上述外源性基因表达载体含有能够强力诱导目的基因的表达的启动子。

背景技术

基因重组技术是在进行基因的功能解析、有用蛋白质的生产方面必要的技术。在有用蛋白质的生产中，以往，主要是将大肠杆菌、酵母作为宿主利用，但是存在大量生产困难的大问题。因此，近年，能够短时间内合成大量蛋白质的家蚕(Bombyxmori)，作为蛋白质的大量生产系受到注目。将家蚕作为宿主时，重要的是将外来基因导入细胞内的转化体，即重组家蚕(转基因家蚕)的制作技术。已确立了对家蚕使用转座子piggyBac将外来基因稳定维持在基因组内的技术(非专利文献1)。

但是，基因重组技术中，除了制作转化体的技术之外，需要正确且简便判断保有导入的外来基因的转化体和未保有其的宿主(非转化体)的技术。宿主是昆虫时，采用进行转化处理时与目的基因一起将荧光蛋白质等标记基因(标记物基因)以及控制它们表达的启动子导入，基于标记基因的表达的有无判断是否为转化体的方法。因此，该方法中，重要的是选择能够强力且大范围诱导标记基因的表达的启动子。

家蚕中，作为上述启动子，主要使用全身性的肌动蛋白A3基因启动子(非专利文献1和2)、各种生物种类中通用性高的已知的眼特异的3xP3启动子(非专利文献3)和作为最初期启动子的IE1启动子(非专利文献4)。但是，这些启动子存在以下所示的问题点。

首先，对于A3启动子，由于在胚期间启动子的活性弱，因此如图1B所示在发育初期不能判断转化体。因此，在能够确认标记基因的表达的幼虫期之前，需要将进行转化处理的个体全部一样地饲养。因此作业中产生很多时间、操作以及成本的浪费。此外由于幼虫到处移动，因此基于标记基因的表现型难以在可见光下肉眼不能以体色的形式进行判断时，还存在难以进行选拔作业的问题。例如，标记基因编码荧光蛋白质时，必须边对到处移动的家蚕的幼虫持续照射激发光，边选拔发出荧光的个体。

其次，对于3xP3启动子的情形，由于从胚期具有启动子活性，A3启动子中出现的问题不会发生。但是，如图1D所示，由于表达部位局限于胚的极少一部分(图中箭头所示的部分)，其识别和判断需要熟练的技术。此外，将具有该启动子的表达载体插入宿主基因组内时，因插入位置效果等而会抑制目的基因的表达，此时，即使是熟练者也难以判断。而且，还存在发育初期阶段能够确认靶基因的表达的时间仅仅为1～2天时间这样的问题。

另外，对于IE1启动子的情形，脂肪体、精巢、卵巢中不会发现表达诱导活性，存在基因表达诱导的活性不是全身性这样的问题。

现有技术文献

非专利文献

非专利文献1:TamuraT.etal.，2000，NatBiotechnol，18：81-84.

非专利文献2:Imamura，M.，etal，2003，Bombyxmori.Genetics165：1329-1340.

非专利文献3:ThomasJ.-L.etal.，2002，InsectBiochemMolBiol，32：247-253.

非专利文献4:Masumotoetal.，2012PLoSOnee49323

发明内容

本发明的目的在于开发一种在胚整体上强力诱导标记基因的表达的启动子，以便于在发育初期阶段就简便、有效且正确判断转基因昆虫，进而提供一种引入上述启动子的基因表达载体作为转化体判断标记物。

此外，本发明的目的在于提供一种如下的基因表达载体，其利用上述启动子的活性，在从发育初期阶段至整个发育阶段，能够强力表达编码所需的蛋白质的基因。

为了解决上述课题，本发明人等制作了在基因组中随机插入转座子的庞大数目的家蚕的增强子陷阱系统。而且，从中成功分离了具有用于解决该课题所期望的性质即从发育初期阶段开始在全身能够强力表达报告基因的系统(AyFib-431a系统)。解析该系统的基因组中的转座子的插入位置的结果，解明了插入hsp90基因的5’-UTR内部，hsp90基因启动子诱导转座子内的报告基因的表达。

本发明是基于该见解的，提供以下内容。

(1)一种外源性基因表达载体，其包含启动子，上述启动子是含有序列编号1所示的碱基序列的多核苷酸。

(2)根据(1)记载的外源性基因表达载体，其中，上述外源性基因表达载体包含启动子，上述启动子是含有序列编号2所示的碱基序列的多核苷酸。