[发明专利]表达O型口蹄疫病毒空衣壳的重组缺损型腺病毒及其构建方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及重组缺损型腺病毒，尤其涉及稳定表达O型口蹄疫病毒空衣壳的重组缺损型腺病毒株，本发明还涉及所述重组缺损型腺病毒株的构建方法及其在制备预防或治疗口蹄疫的药物或试剂中的应用，属于口蹄疫的防治领域。

背景技术

口蹄疫(FMD)是偶蹄动物的一种急性、热性、高度接触性传染病，其病原为口蹄疫病毒(FMDV)。鉴于口蹄疫对世界经济造成的严重危害，国际兽疫局(OIE)和联合国粮农组织(FAO)将其列为必须通报的疾病，中国也将其列为一类动物传染病的第一位。疫苗接种是特异性预防FMD的有效手段，安全有效的疫苗是成功预防、控制乃至最终消灭FMD的先决条件。

研究表明，口蹄疫病毒衣壳蛋白前体P1包含FMDV的主要抗原决定簇，并在3C蛋白酶的裂解作用下参与病毒衣壳的组装，组装的FMDV空衣壳与FMDV感染细胞所产生的早期未成熟病毒颗粒十分相似，可诱导机体产生细胞免疫和体液免疫应答，从而保护动物免受FMDV的攻击。FMDV 3C蛋白是一种丝氨酸蛋白酶，负责FMDV多聚蛋白前体的裂解与成熟。在多聚蛋白前体的裂解过程中，除了前导蛋白可自行从与P1连接处断裂成熟以及2A负责将P1区与P2区自动裂解以外，其余多聚蛋白前体成分都依靠3C蛋白酶的剪切加工而形成具有生物活性的病毒蛋白。FMDV基因组编码的3C蛋白酶不仅在多聚蛋白的裂解成熟过程中发挥着重要作用，而且有证据表明它可以破坏宿主细胞中维持正常生理活动的蛋白复合物。3C蛋白酶可以切割eIF4A，而eIF4A是细胞合成自身蛋白所需的一种重要的翻译起始因子，并且对于mRNA的解旋起重要作用。因此，FMDV 3C蛋白酶又是一个诱导宿主细胞凋亡的毒力因子。

鉴于FMDV 3C蛋白酶的这种双重的矛盾角色，在保证3C蛋白酶对口蹄疫病毒衣壳蛋白的剪切作用以及空衣壳的组装和形成的前提下，通过对3C基因的改造改变3C蛋白酶的活性，减低3C蛋白酶活性及其对细胞的毒性作用，从而增强表达空衣壳重组腺病毒在动物体内的免疫原性，对于有效预防和控制FMD均具有重要的意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是通过对O型口蹄疫病毒3C基因的改造改变3C蛋白酶的活性，在保证3C蛋白酶对口蹄疫病毒衣壳蛋白的剪切作用以及空衣壳的组装和形成的前提下，减低3C蛋白酶活性，增强表达空衣壳重组缺损型腺病毒在动物体内的免疫原性，最终筛选获得两株稳定表达O型口蹄疫病毒空衣壳的重组缺损型腺病毒株。

为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：

本发明首先拼接获得了编码O型口蹄疫病毒空衣壳的亚基因组P1-2A-3C，其核苷酸序列为SEQ ID No.1所示。

本发明在含有O型FMDV O/YS/CHA/05株P12A基因的重组质粒pOK-P12A上利用引物引入耐酸突变位点，获得质粒pOK-P12A-N17D；在含有3C基因的重组质粒pOK-3C上利用引物引入艾滋病病毒HIV-1frameshift基因序列和突变位点C142T，获得质粒pOK-3C-FS-142；将上述构建的重组质粒分别酶切、目的片段连接获得重组质粒pOK-O-FS-P12A3C，实现3C蛋白酶活性改变的O型FMDV基因组P1、2A和3C基因的拼接，得到SEQ ID No.1所示的编码O型口蹄疫病毒空衣壳的亚基因组P1-2A-3C。

本发明进一步根据质粒pOK-O-FS-P12A3C的基因序列设计突变引物，用于扩增pOK-O-FS-P12A3C质粒上的P12A3C基因，构建质粒pOK-Om-FS-P12A3C，进一步获得编码O型口蹄疫病毒空衣壳的亚基因组P1-2A-3C的突变体，其核苷酸序列为SEQ ID No.2所示。

研究表明，近年来中国流行的O型FMDV毒株在VP1的G-H loop小产生两个氨基酸残基的变异造成了一个优势中和表位的明显改变，导致抗原变异株的产生(中国发明专利授权公告号：CN101838658B)。本发明在上述构建的质粒pOK-O-FS-P12A3C的基础上，设计突变引物进行定点诱变，构建了3C蛋白酶活性改变的表达O型FMDV变异株P1-2A-3C基因的重组腺病毒rAdV-Om-FS-P12A3C，此O型突变体重组腺病毒(rAdV-Om-FS-P12A3C)与重组腺病毒rAdV-O-FS-P12A3C比较，只是在于上述两个氨基酸的不同，其余的基因及其氨基酸序列均未发生任何变化。