[发明专利]一种基于TALEN介导的Sp110巨噬细胞特异打靶载体及重组细胞

说明书

技术领域

本发明属于转基因克隆动物技术领域，涉及一种基于TALEN介导的Sp110巨噬细胞特异打靶载体及重组细胞。

背景技术

牛结核病是由牛分支杆菌(Mycobacterium bovis,M.bovis)和结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)等结核分支杆菌复合群引起的一种慢性消耗性传染疾病，其主要表现为牛生产力明显下降、乳房炎和结核性胸膜炎等症状。牛结核的传播和流行严重影响了地区农业经济的发展，特别是对动物及动物产品的国际贸易有着重大的影响(Biet et al.,2005)。

SP110核体蛋白基因(SP110nuclear body protein)是新近发现的介导结核分枝杆菌天然免疫的一个基因，该基因能够限制结核分枝杆菌在巨噬细胞内的繁殖，并且能调节巨噬细胞的死亡方式(Behar,2011)。SP110基因的发现为预防牛结核病的流行和传播提供了一种新思路。

TALEN(Transcription Activator-Like Effector nucleases)是由植物致病细菌Xanthomonas分泌的一类具有转录激活功能的蛋白。由于TALE的DNA结合域中的重复氨基酸序列模块可以与单碱基发生特异性结合，因此理论上可以任意选择靶DNA序列进行改造，是一种非常有效的基因组改造工具酶。TALENs由于具有一些比锌指核酸酶(ZFNs)更优越的特点，现在成为了科研人员用于研究基因功能和潜在基因治疗应用的重要工具。应用TALEN介导的基因组修饰已成功应用于多种模式动物，如果蝇、斑马鱼、小鼠、大鼠等。

转基因动物在家畜品种改良方面具有巨大的应用潜力。在实际生产中，转基因技术可以改善动物肉质，提高增长率、饲料利用率，改善乳质及其成分，改良繁殖性能等(Niemann et al.,2005)。通过转基因技术，提高动物自身对结核分支杆菌的抵抗力将是今后控制牛结核病的重要思路。

发明内容

本发明解决的问题在于提供一种基于TALEN介导的Sp110巨噬细胞特异打靶载体及重组细胞，在牛28号染色体M-S位点定点整合SP110基因构建牛胎儿成纤维细胞系，以该细胞系作为核供体细胞，为研制抗结核病的转基因牛提供坚实的基础。

本发明是通过以下技术方案来实现：

一种基于TALEN介导的Sp110巨噬细胞特异打靶载体，包括TALEN真核表达载体和打靶载体；

所述的TALEN真核表达载体包括TALEN左臂表达载体和TALEN右臂臂表达载体，分别识别TALEN靶点的上游和下游识别位点，TALEN靶点位于牛基因组28号染色体SFTPA1和MAT1A基因的基因间序列；

所述的打靶载体上克隆有重组基因MSR1-Sp110-PolyA，并克隆有作为同源臂的TALEN靶点上游和下游的同源序列；

所述的重组基因MSR1-Sp110-PolyA是在Sp110基因的上游连接牛巨噬细胞特异性启动子MSR1，在下游连接PolyA。

所述的TALEN左臂表达载体上克隆有TALEN左臂，其核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示；

所述的TALEN右臂表达载体上克隆有TALEN右臂，其核苷酸序列如SEQ.ID.NO.2所示。

所述还在TALEN左臂/TALEN右臂的下游连接T2A间隔、荧光标签GFP和mCherry。

所述的重组基因MSR1-SP110-PloyA中，SP110的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.3所示，MSR1的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.4所示。

所述的同源臂包括分别位于重组基因MSR1-SP110-PloyA上游、下游的上游同源臂和下游同源臂，上游同源臂与MSR1-SP110-PloyA之间还设有一对同向的Loxp，Loxp之间设有第一筛选基因，下游同源臂的下游还设有第二筛选基因。

所述上游同源臂的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.5所示，下游同源臂的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.6所示。

所述的TALEN真核表达载体为pCS2-TALEN，其TALEN左臂表达载体和TALEN右臂表达载体，分别通过在pCS2-Fok I载体上连接TALEN左臂、TALEN右臂而构建；