[发明专利]鸡白痢沙门氏菌的PCR检测引物及检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及鸡白痢沙门氏菌的分子生物学检测，具体地说，涉及鸡白痢沙门氏菌的PCR检测引物及检测方法。

背景技术

PCR技术是近二十年发展成熟的一种体外扩增特异性DNA片段的技术，具有简便、快速、敏感性高和特异性强等优点。因而从上世纪90年代以来开始尝试利用该技术来检测食品中以及临床样品和环境中的沙门氏菌。但到目前为止，相关的PCR技术只能鉴定到沙门氏菌属，无法直接区分血清型，通常还需要结合生化鉴定和血清学实验进行分型。近几年，随着一些沙门氏菌血清型测序的完成，国外开始有研究根据鸡白痢沙门氏菌特有的基因序列进行PCR检测，以达到特异性检测鸡白痢沙门氏菌的目的，国内相关研究较少。而目前对鸡白痢沙门氏菌的特异性PCR检测大多是根据rfbs基因进行的，例如根据第598和237位点上的碱基多态性进行检测，但这两个位点上的多态性还有待扩大群体验证。2010年李求春等报道了ipaJ基因与鸡白痢的Ⅲ型分泌系统有关，其特异性已得到多位学者的认可。

Soumet等(1999年)利用多重PCR结合改良MSRV培养基的方法实施肠炎沙门氏菌的特异性检测，主要是依据沙门氏菌属特异性片段设计引物ST11-ST15，根据sefA基因设计引物sef167-sef478，用此方法检测了1078份鸡舍环境棉拭子，证明其敏感度(95％)高于传统方法的敏感度(92.5％)。

薛俊龙等(2011年)用鸡白痢沙门氏菌fliC基因序列建立特异性PCR诊断方法，此PCR体系能检出50pg以上的细菌DNA，阳性检出率和敏感性均高于常规检测方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种可快速、准确地检测鸡白痢沙门氏菌的特异性引物及含有该引物的试剂盒。

本发明的另一目的是提供基于上述引物及试剂盒，建立鸡白痢沙门氏菌的特异性PCR检测方法。

为了实现本发明目的，本发明根据鸡白痢沙门氏菌(Salmonella Pullorum)特有的ipaJ基因(GenBank：GU949535.1)设计了一对特异性PCR引物，扩增产物大小为161bp，引物序列如下：

正向引物ipaJ-F：5’-ATTAACAGGAGGAGGCTGG-3’(Seq ID No.1)

反向引物ipaJ-R：5’-CCATTCCCAAAAGCCTGCAT-3’(Seq I D No.2)

本发明还提供含有上述引物的用于检测鸡白痢沙门氏菌的试剂盒。

优选地，所述试剂盒还包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg²⁺、PCR反应缓冲液等中的至少一种。

更优选地，所述试剂盒还包括标准阳性模板。

本发明还提供鸡白痢沙门氏菌的PCR检测方法，利用上述引物或试剂盒对鸡白痢沙门氏菌进行PCR检测。包括以下步骤：

1)提取样品中的DNA；

2)以步骤1)中提取的DNA为模板，ipaJ-F和ipaJ-R为引物进行PCR扩增反应；

3)分析PCR产物。

PCR反应体系以15μl计为：

PCR反应条件为：95℃5分钟；95℃1分钟，55℃1分钟，72℃1分钟，共34个循环；72℃10分钟。

本发明提供的鸡白痢沙门氏菌的PCR检测方法，操作简便，易于掌握，便于推广，一般的分子实验室都可进行，仅需2天即可完成。同时本方法具有抗干扰能力强，灵敏度高，特异性强的优点，完全可以满足在家禽及其产品中快速、特异性检测鸡白痢沙门氏菌的需求。无论是家禽养殖场，还是禽产品加工厂，都可以选择最近的分子实验室进行检测，及时确诊鸡白痢沙门氏菌污染情况，将经济损失及对公共健康的危害降到最低。

附图说明

图1为本发明实施例1中鸡白痢沙门氏菌ipaJ基因特异性检测结果；其中，M：DNA分子量标准，N：空白对照，1：大肠杆菌，2：伤寒沙门氏菌，3：猪霍乱沙门氏菌，4：肠炎沙门氏菌，5：鸡伤寒沙门氏菌，6：鸡白痢沙门氏菌。

图2为本发明实施例2中鸡脾脏组织中检测鸡白痢沙门氏菌结果部分胶图；其中，M：DNA分子量标准，P：阳性对照，1-23：脾脏组织样本。

图3为本发明实施例3中鸡蛋3个不同部位中鸡白痢沙门氏菌检测结果部分胶图；其中，M：DNA分子量标准，P：阳性对照，1-23：蛋黄样本。