[发明专利]烟草ε-番茄红素环化酶基因及其应用

说明书

本发明公开了一种烟草ε‑番茄红素环化酶基因，其碱基序列如SEQ ID NO：1所示。本发明通过同源克隆的方式，从栽培烟草红花大金元体内克隆获得Ntε‑LCY基因序列，并且进行了表达模式及亚细胞定位分析。利用烟草脆裂病毒（Tobacco rattle virus，TRV）诱导基因沉默注射本氏烟草，结果表明ε‑LCY的部分沉默可以提高烟叶中类胡萝卜素含量，并且增强烟株抵御光抑制的能力。该研究结果能够为利用基因工程技术培育优良品种提供理论依据和基因资源。

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，具体涉及在烟草中，一种类胡萝卜素合成关键基因 Ntε-LCY及其应用。

背景技术

类胡萝卜素是自然界广泛存在的一类重要萜类物质，一切光合组织中都能合成此类物质。高等植物类胡萝卜素合成通路产生的中间物质如α-胡萝卜素(α-carotene)、β-胡萝卜素 (β-carotene)、黄体素(lutein)、新黄质(neoxanthin)、紫黄质(violaxanthin)、玉米黄质(zeaxanthin)等参与了高等植物体内诸多重要的生理过程。类胡萝卜素在光合作用中起重要作用，是光合作用中光传导途径和光反应中心的重要组成部分，作为叶绿体光合天线的辅助色素，有助于叶绿体吸收光能；另一方面，类胡萝卜素在高温、强光下能通过叶黄素循环，以非光化学辐射的方式耗散光系统II(PSII)的过剩能量，保护叶绿素免受氧化损伤的破坏。此外，类胡萝卜素也是合成植物激素脱落酸(ABA)的前体物，ABA广泛地参与植物生长周期发育的各个环节和抗逆过程。番茄红素环化是该通路的一个重要分支点，番茄红素在番茄红素β-环化酶(lycopeneβ-cyclase,β-LCY)或者番茄红素ε-环化酶(lycopeneε-cyclase,ε-LCY) 的作用下形成为β-胡萝卜素或者δ-胡萝卜素。ε-LCY和β-LCY两个酶的活性在一定程度上决定了两个分支产物黄体素、β-胡萝卜素、紫黄质、玉米黄质等胡萝卜素类物质的比例。植物中众多的研究实例都表明ε-LCY是调控黄体素和β-胡萝卜素含量比例的关键酶。ε-LCY在玉米体内的自然变异能够解释玉米品种间58％的黄体素和β-胡萝卜素含量差异。拟南芥ε-LCY的表达抑制株系也出现了黄体素和β-胡萝卜素含量比例的显著变化，土豆ε-LCY的表达抑制同样造成了β-胡萝卜素含量的显著上升。油菜种子中ε-LCY的表达抑制导致β-胡萝卜素、紫黄质和玉米黄质等物质含量的上升，但是黄体素的含量也大幅提高，这表明不同植物体内可能存在不同的遗传机制或调控机制。

类胡萝卜素是一类重要的香味前体物，其通过降解、转化可形成一系列的致香物质。烟叶中类胡萝卜素的含量不但决定了烤后烟叶的外观品质，同时也能够影响烟叶的吸食品质，其降解产物占烟叶总挥发性香气成分的8％-12％。类胡萝卜素的降解和热裂解产物可生成近百种香气化合物，如巨豆三烯酮、β-大马酮等，这些香味物质阈值相对较低，刺激性较小，对烟叶香气贡献率大，是形成烤烟细腻、高雅和清新香气的主要成分。Weeks研究发现，在烟叶品质提高的同时，类胡萝卜素降解物含量明显增加。对β-胡萝卜素降解产物进行了加香实验，结果表明添加β-胡萝卜素的降解产物能够丰满烟气，增浓烟香。

发明内容

本发明的目的探索一种利用基因工程方法增加类胡萝卜素的合成效率，尤其是β-胡萝卜素合成的效率。

本发明的技术方案是：烟草ε-番茄红素环化酶基因，其碱基序列如SEQ ID NO：1所示。烟草ε-番茄红素环化酶基因，其编码序列如SEQ ID NO：2所示。

所述的烟草ε-番茄红素环化酶基因的应用，所述烟草番茄红素ε环化酶基因提高烟草类胡萝卜素含量。

一种提高烟草类胡萝卜素含量的方法，通过瞬时表达技术干扰、沉默烟草番茄红素ε环化酶基因，获得类胡萝卜素含量提高的烟草转化植株。

所述的提高烟草类胡萝卜素含量的方法，以所述烟草番茄红素ε环化酶基因的特异性核苷酸片段作为引导序列，将特异性核酸片段以正反两个方向插入到植物表达载体中，构建烟草番茄红素ε环化酶基因的病毒诱导基因沉默载体和RNAi载体。