[发明专利]一种用于扩增嗜冷杆菌属的特异性引物

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于扩增嗜冷杆菌属的特异性引物，可用于对样品中嗜冷杆菌的分子检测。

背景技术

嗜冷杆菌属(Psychrobacter)细菌，分类于莫拉氏菌科(Moraxellaceae),包括静止嗜冷杆菌(P.immobilis)、粪嗜冷杆菌(P.faecalis)、居冷嗜冷杆菌(P.frigidicola)、冷栖嗜冷杆菌(P.glacincola)等共9种细菌。该属的菌株为革兰氏阴性需养杆菌或球菌，其大小为(0.9-1.3)um×(1.5-3.8)um无动力，需氧，能够在5℃下生长，一般在35-37℃范围内不能生长，氧化酶和接触酶均为阳性，因在低温下生长良好而得名。主要分布于常冷的环境如南北两极地区、高山、冰川、冷库、深海和土壤等低温环境中，它能通过特殊的生理机制适应环境温度的变化，在对污水中油烃类，氯酚类等物质的生物降解、催化低温发酵、表达热不稳定蛋白质以及生产抗冻保护剂等方面有着广泛的应用。

嗜冷杆菌的分离主要是依赖选择性培养基分离培养的经典生物学方法，然后通过细菌生理生化特性进行分类鉴定。但该法分离周期长，工作量大且不易获得目的功能菌株和纯菌株，这使得嗜冷杆菌的发现和分离具有偶然性和随机性，大大降低了挖掘这一特定种属菌株资源的几率。随着分子生物学的飞速发展，基于PCR的分子检测技术已在环境微生物研究中应用越来越普遍。通过对菌株进行DNA提取，使用细菌16srDNA通用引物27F/1492R扩增目的片段，测序可得知其基因序列，但该法的特异性不强，特别是多种菌共存的混合DNA样品，尚无法用现有的引物对从混合DNA样品中直接扩增出具有嗜冷杆菌(Psychrobacter)遗传特性的16srDNA V3可变区域部分序列，给土壤中嗜冷杆菌的检测研究带来了困难。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于扩增嗜冷杆菌的特异性引物，以改进公知技术中存在的缺陷。

为实现上述目的，本发明提供的用于扩增嗜冷杆菌属的特异性引物为：5′-AAGACTCTACGGTTAATACCCA-3′。

所述的特异性引物中，5′-AAGACTCTACGGTTAATACCCA-3′为正向引物；5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′为反向引物。

本发明的用于扩增嗜冷杆菌的特异性引物可以解决目前缺乏引物从混合DNA样品中直接扩增出具有嗜冷杆菌(Psychrobacter)遗传特性的16srDNA V3可变区域部分序列的问题。

附图说明

图1为实施例1中PsyF/1492R引物对6种属细菌DNA扩增产物的凝胶电泳图。

图2为实施例2中PsyF/1492R引物对土壤样品DNA扩增产物的凝胶电泳图。

具体实施方式

本发明以特异性引物5′-AAGACTCTACGGTTAATACCCA-3′(命名为PsyF)作为正向引物，与5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′(通用引物中的1492R)为反向引物配对使用，即可从各类样品DNA中直接扩增出长度大约为1078bp的嗜冷杆菌目的片段。

以下结合实施例进行说明，但本发明的技术方案不局限于以下所列举的实施例，还包括个具体实施例间的任意组合。

实施例一

分别以嗜冷杆菌(Psychrobacter)，黄杆菌(Flavobacterium)，肠杆菌(Enterobacter)，节杆菌(Arthrobacter)，芽孢杆菌(Bacillus)和假单胞菌(Pseudomoans)6个属细菌DNA为模板进行引物PsyF/1492R的特异性验证试验。

PCR扩增体系为：25μL由0.5μL DNA模板(约10ng)、2.5μL正向引物PsyF(10pM)、2.5μL反向引物1492R(10pM)、2.5μL 10×PCR buffer(含Mg2+)、2.0μL dNTP s(2.5mmol/L)、0.1μL Taq DNA聚合酶(5U/μL)，灭菌双蒸水补足25μL。PCR扩增反应条件为：预变性95℃，5min，变性94℃1min，退火50℃50s，延伸72℃1min，共30个循环，72℃延伸10min，4℃保存。