[发明专利]UHPLC-CAD技术同时测定血清中6种镇静催眠类药物含量的方法

权利要求书

1.UHPLC-CAD联用技术同时测定血清中6种镇静催眠类药物含量的方法，所述的6种镇静催眠类药物为地西泮、劳拉西泮、阿普唑仑、艾司唑仑、氯硝西泮、取酒石酸唑吡坦其特征在于该方法包括以下的步骤：

1）对照品的配制

精密称取地西泮、劳拉西泮、阿普唑仑、艾司唑仑、氯硝西泮、取酒石酸唑吡坦对照品，分别置于容量瓶中，加入乙腈溶解，配成所需质量浓度的对照品溶液，备用，精密量取6种对照品溶液，配成所需质量浓度的混合对照品溶液，备用；

2）内标溶液的配制

精密称取秋水仙碱对照品，置于容量瓶中，加入乙腈溶解，配成所需质量浓度的内标溶液，备用；

3）样品溶液制备

按照睡眠障碍诊断标准，入选患者，临床医生根据症状给予1种或数种镇静催眠药物进行治疗，患者服药后定时取血，分离血清，置于具塞离心试管中，定量加入步骤2）的秋水仙碱内标溶液，涡旋混匀，高速离心后，分离上清液；上清液中加入至甲醇和水活化后的SPE柱，上样后用水淋洗，适当浓度的甲醇洗脱，洗脱液挥干，用乙腈溶解，即得样品溶液，备用；       

4）流动相溶液的配制

取色谱纯乙腈，作为流动相A相，备用；取纯水，作为流动相B相，备用；

5）色谱条件的设置

选择以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，规格为4.6×250mm，填料内径为5.0μm的色谱柱；柱温为30℃，流动相流速为0.8mL/min；取步骤1）的对照品溶液与步骤2）的内标溶液，定量进样，进行梯度洗脱；采用电喷雾检测器进行色谱峰检测；

6）电喷雾检测器条件优化

选择电喷雾检测器，氮气压力为35psi，量程100pA，雾化温度30℃；

取步骤1）对照品溶液、步骤2）的内标溶液，定量进样，由此得到对照品及内标物的标准色谱图；

7）样品测定

取步骤3）的样品溶液，分别定量进样，在步骤5）与步骤6）的条件下，测定，分别得到地西泮、劳拉西泮、阿普唑仑、艾司唑仑、氯硝西泮、酒石酸唑吡坦对照品，秋水仙碱内标物以及样品的色谱图，样品图谱中，与地西泮、劳拉西泮、阿普唑仑、艾司唑仑、氯硝西泮、酒石酸唑吡坦对照品以及秋水仙碱内标物相同保留时间处，为血清样品中的待测地西泮、劳拉西泮、阿普唑仑、艾司唑仑、氯硝西泮、酒石酸唑吡坦，以及定量加入的秋水仙碱内标物；

8）梯度浓度对照品溶液的配制

精密吸取步骤1）的地西泮、劳拉西泮、阿普唑仑、艾司唑仑、氯硝西泮、酒石酸唑吡坦对照品溶液，配制成混合对照品溶液，加乙腈，稀释成梯度浓度的混合对照品溶液，备用；

 9）标准曲线制备

取睡眠障碍的患者空白血清多份，分别定量加入步骤8）的梯度浓度混合对照品溶液，按照步骤3）方法操作，得到梯度加标样品溶液，在步骤7）的条件下进行测定；以地西泮、劳拉西泮、阿普唑仑、艾司唑仑、氯硝西泮、酒石酸唑吡坦峰面积与内标物峰面积的比值对地西泮、劳拉西泮、阿普唑仑、艾司唑仑、氯硝西泮、酒石酸唑吡坦峰的浓度进行线性回归，得到回归方程，地西泮的标准曲线：y = 0.0635x-0.5842 (r=0.9940)，劳拉西泮的标准曲线：y=0.0758x- 0.5796 (r=0.9968)，阿普唑仑的标准曲线：y =0.0813x-0.6502 (r=0.9946)，艾司唑仑的标准曲线：y=0.0666x-0.5455 (r=0.9939)，氯硝西泮的标准曲线：y= 0.0622x-0.4402 (r=0.9972)，酒石酸唑吡坦的标准曲线：y=0.1428x-0.6019 (r=0.9963)；其中y为被测物峰面积与内标物峰面积的比值，x为被测物质量浓度；

 10）数据分析计算

记录地西泮、劳拉西泮、阿普唑仑、艾司唑仑、氯硝西泮、酒石酸唑吡坦和秋水仙碱的峰面积，计算6种药物与内标秋水仙碱峰面积的比值，分别代入各自的标准曲线，计算出6种药物的质量浓度；即为血清中药物的浓度。

2.根据权利要求1所述的UHPLC-CAD技术同时测定血清中6种镇静催眠类药物含量的方法，其特征在于步骤5）的梯度洗脱程序如下：0-7.00min，45%A相和55%B相；7.01min-15.00min，70%A相和30%B相；15.01min-20.00min，45%A相和55%B相。