[发明专利]用于获得无标记转基因植物的农杆菌专用载体组合物及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及用于获得无标记转基因植物的农杆菌专用载体组合物及其应用。 

背景技术

植物转基因技术是进行基因功能研究和通过基因工程进行植物遗传改良的重要工具。自1996年首例转基因作物商业化种植以来，目前世界各国已累计批准23种转基因作物进行商业化生产，涉及13类目标性状，包括抗虫、抗除草剂、抗病、育性改变、品质改良等。以抗除草剂和抗虫为主的大豆、玉米、棉花、油菜等转基因作物已经在全球22个国家和地区种植，2012年种植面积已达1.7亿公顷。转基因作物产业化已成为全球新的经济增长点，是增强农业国际竞争力的重要保障。 

目前植物遗传转化方法众多，其中根癌农杆菌介导法(Agrobacterium-mediatedtransformation)和基因枪轰击法(particle bombardment transformation)是植物遗传转化的主要方法。两种方法各有优缺点，农杆菌介导法外源基因在植物遗传转化中的转化机理清楚、整合位点较稳定、拷贝数低、整合后的外源基因结构变异较小、遗传稳定性好，但存在受体基因型限制和骨架序列整合的缺点；基因枪转化法基本不受材料基因型的限制，但却存在转基因植株中整合有载体骨架序列和抗生素标记、目的基因的多拷贝、转基因沉默以及转基因后代遗传稳定性差等问题。 

尽管多数国家对转基因产品的态度日趋积极，但转基因作物的潜在安全风险问题仍然受到公众的普遍关注，特别在欧洲一些国家转基因作物的争议非常激烈。在转基因作物中争议最大的是抗除草剂和抗生素类选择标记可能带来的潜在风险。如在环境方面，由于花粉飘移可能形成超级杂草、增加靶标生物抗性、对生物多样性影响等。在食品安全方面，包括标记基因所表达蛋白质致敏性，以及对受体作物本身营养成分、天然毒素和抗营养物质含量等方面的影响及其它可能的非预期效应。另外标记基因的存在也不利于基因的重复转化。因此建立安全转基因技术体系和培育无标记转基因植物已成为转基因技术研发的主要方向，也是各国在转基因技术领域进行技术创新的热点之一。 

双元载体的发展和Gateway克隆技术的应用大大促进了农杆菌介导的遗传转化在植物基因工程改良中的应用，同时也使其成为获得无选择标记转基因植物的重要工具。从1983年Hoekema等把根癌农杆菌Ti质粒上的vir区和T-DNA区分离并置于两个复制子中，提出双元载体策略以来，双元载体的发展已取得了突破性的进展。双元载体的种类从最早pBin19和pBI121的构建至今二十几年间，已发展了二十多个系列几十种载体，如：pCAMBIA，pMDC和pGreen双元载体系列等。与此同时，双元载体在以下几个方面得到了大幅度的优化：添加广适的复起制点，使其在大肠杆菌和农杆菌中能够自由复制；运用高拷贝复制子，以提高质粒的产量，便于体外亚克隆操作；降低载体质粒的长度和增加T-DNA内限制性内切酶位点，便于外源基因的亚克隆操作。在提高转化效率和增强外源基因表达稳定性方面，通过添加额外的vir基因、T-DNA转移增强序列（overdrive）、基因沉默抑制子等方面的改良，提高植物遗传转化效率和外源基因的稳定表达。双元载体的发展，使农杆菌介导的植物遗传转化技术广泛应用于植物基因研究的各个领域，如RNA干扰、基因过表达、多基因传递、功能基因组和蛋白质组研究等。然而通过传统的酶切、连接方法构建不同用途的载体，不仅耗时耗力， 而且还受到酶切位点的限制，特别是对于高通量的功能基因组和蛋白质组研究来说，载体构建是一个最大的‘瓶颈’。Gateway技术的出现，克服了传统载体构建中遇到的上述问题。 

Gateway克隆技术是Invitrogen公司基于λ噬菌体介导的位点特异性整合和删除系统而开发的。位于特异性位点att间的DNA片段，在重组酶BP Clonase或LR Clonase EnzymeMix的作用下，通过一步反应（attB×attP或attL×attR)便可将DNA片段转移到含相应重组位点的目的载体中，避免了载体构建中的酶切、连接等繁琐步骤。目前已报道了多种Gateway兼容的双元载体，如pW、pMDC、pEarleyGate系列载体，每种载体系列都含有多种不同用途的载体类型。如pW系列载体包括过表达和反义表达载体、用于启动子分析含有LUC、GUS和GFP-GUS等基因的载体、用于基因融合的含GFP基因的载体和用于基因沉默的RNA干扰载体。