[发明专利]一种黑根霉及其应用技术

说明书

技术领域

本发明属于工业真菌技术领域，具体设计一种高产甾体发酵黑根霉菌株及其甾体化合物发酵的应用技术。

背景技术

1甾体化合物C11α-羟化微生物发酵。

   甾体化合物是一类含有环戊烷多氢菲核的化合物，由于母核上取代基、

   双键位置或立体构型的不同，形成了一系列具有独特生理功能的化合物。

羟化反应是甾体微生物转化中最重要的反应，C11羟基对于甾体药物的抗炎活性起到积极的作用。微生物能在甾体的任何位置进行羟基化反应。化学方法除了较易在C17引入羟基外，在其他位置都很难引入。自1952年美国普强（Upjohn）药厂Peterson和Murry最早发现黑根霉（Rhizopus nigricans）对甾体具有C11α-羟化反应后，我国黄鸣龙教授等于1958年用黑根霉使16a，17a-环氧黄体酮氧化引入C11-a羟基，从而研究成功从薯蓣皂素合成可的松的七步法路线，并一直沿用至今。

目前，工业上用于甾体C11α-羟化转化反应的微生物主要有黑根霉（Rhizopus nigricans Ehrenb.）、赭曲霉（Aspergillusochraceus）以及绿僵菌（Metarhiziumspp.）等。对于甾体C11α-羟化反应，工业上依然大量使用黑根霉，因为黑根霉性状稳定，发酵杂质少，单杂含量低，发酵技术成熟，转化率和得率也较稳定。而经过多年选育后的黑根霉，通过投料方式等方面改进，在转化率上比以往提高了1倍，相比其他C11α-羟化反应菌种，转化率过低的劣势得到了改善。依靠菌种选育手段的不断更新，黑根霉在甾体C11α-羟化反应中，还将扮演重要角色。

2黑根霉的分类地位及利用现状。

黑根霉（Rhizopusnigricans）属于真菌界（Fungi），接合菌门（Zygomycota），毛霉目（Mucorales），根霉科（Rhizopodaceae）。

在用本菌株催化底物沃氏氧化物进行11α-羟基化反应，葡萄糖与糊精作为培养基碳源时的转化率较高。其中，葡萄糖较易被微生物利用并转化成菌体生长所需的能量和碳成分，且价廉易得，广泛应用于微生物实验和工业化生产．因此，选用葡萄糖为最佳碳源。

通常黑根霉在15～35℃条件下都能生长，其中以25～30℃为最适生长温度。菌丝生长和孢子形成的最适温度为28～30^oC。黑根霉生长发育要求空气相对湿度在90％以上。孢子的存活受物理和化学因素的影响。

发明内容

本发明目的是提供一种黑根霉新菌株，其生产霉菌氧化物具有转化率高、收率高，而且生物学性状比较稳定等特点，可以为以薯蓣皂甙为原料的植物甾体激素生产提高产量、降低生产成本提供技术支持。

本发明的另一目的是提供所述黑根霉新菌株的在以沃氏氧化物为底物制备霉菌氧化物中的应用。

本发明的再一目的是提供所述黑根霉新菌株在以沃氏氧化物为底物生产霉菌氧化物的方法。

实现本发明上述目的采取的技术方案是：所述黑根霉菌株属于真菌界，接合菌门，毛霉目（Mucorales），根霉科，，菌种保藏于“中国普通微生物菌种保藏管理中心”，保藏时间为2013年06月08日，保藏号为：CGMCC No.7687。

该所述的黑根霉菌株CGMCC No.7687在以沃氏氧化物为底物制备霉菌氧化物中进行应用。

本发明所述生产霉菌氧化物的方法包括以下步骤：

⑴原种复活：在原种生长温度条件下，在酵母膏琼脂培养基试管斜面上培养，直到气生菌丝长满斜面并出现大量黑色分生孢子；

⑵制备菌悬液：取无菌水倒入培养好的试管斜面中，用接种针搅拌打下气生菌丝上的孢子制备成菌悬液，再取菌悬液稀释后，涂布在酵母膏琼脂培养基平板上，在生长温度条件下培养；

⑶制备试管斜面：在培养的酵母膏琼脂培养基平板上选择单个菌落接种在酵母膏琼脂培养基试管斜面上，在生长温度条件下培养；

⑷制备种子液：将试管斜面培养的菌种制备成菌悬液并移入已经灭菌的摇瓶培养液中，在生长温度条件下，在摇床上培养，获得种子液；

⑸投料发酵：投入沃氏氧化物到种子液中摇瓶发酵培养，在菌种生长条件下，培养得到发酵液；

⑹结果检测：将每个摇瓶的发酵液经“煮沸-抽滤-粉碎-加入丙酮蒸发-回流-再抽滤-浓缩-结晶”程序后，将结晶物抽滤得到粗制品和母液，将粗制品烘干称取粗制品重量，根据投料量计算粗制品收率和转化率；