[发明专利]一种植物组培外植体抗褐化消毒剂

说明书

技术领域

本发明属农林领域的植物组织培养技术，具体涉及组培外植体消毒与抗褐化方法。

技术背景

植物组织培养技术种苗生产、脱除病毒、种质改良等具有广阔的市场前景。目前植物组织培养技术环节还存在不少问题，外植体污染的防治是组织培养成功的主要难点。常规的外植体消毒方法是先用70％酒精浸泡10-30s，以无菌水冲洗2-3次，0.1％氯化汞浸8-12min或用2％次氯酸钠(饱和次氯酸钙溶液)浸泡15-20min。氯化汞虽然消毒效果好，但常温下微量挥发，可渗透皮肤，对人毒性极强，致死量为0.05克，对环境危害大，2013年10月中国签署《水俣汞污染防治公约》，汞制剂的生产应用将更加严厉控制。次氯酸钠(钙)放出活性氯离子从而杀死菌体，消毒效果较氯化汞差，产生的氯气对人体刺激大，有毒，次氯酸钠溶液氧化性很强，对植物材料有较大的破坏致死作用。此外，使用抗生素消毒，杀菌范围窄，抗生素溶液需过滤除菌，植物易产生抗药性，也易引起材料生理变异。

目前组培外植体消毒仍然首选氯化汞和次氯酸钠。不含汞或次氯酸钠(钙)的外植体消毒剂专利《苔藓植物作为植物外植体消毒剂的用途、及该消毒剂组合物及其制备方法和使用方法》(公布号：101632392)，消毒剂成分为苔藓植物提取液，还包括渗透剂、稳定剂和助溶剂，但消毒剂原材料并不普及，提取程序繁琐，成本高，可能将限制该发明的广泛推广应用。专利《外植体的表面灭菌方法》(公布号：101461329)用酒精、溴水前后消毒外植体，溴水对植物有较强氧化损伤，消毒效果一般，并非首选消毒剂。而其他关于外植体消毒剂专利仍使用氯化汞或次氯酸钠，如公布号1628507A、101138317A、102326514A、101946809A。

外植体褐化也是组织培养成功的三大障碍之一，克服外植体褐化的方法主要有：(1)选择适当的外植体采集季节和部位。(2)抗氧化剂浸泡外植体。(3)培养基添加抗氧化剂、抗氧化酶活性促进剂和酚类(色素)物质吸附剂。(4)培养物多次转移到新鲜培养基。其中(2)和(3)普遍采用的抗氧化剂主要有抗坏血酸、半胱氨酸、柠檬酸、亚硫酸盐。增强植物外植体内抗氧化酶活性的物质油菜素内酯，酚类(色素)物质吸附剂有聚乙烯吡咯烷酮或活性炭。如专利公布号CN103250645A、CN102986534、CN102986533、CN103004754A、CN102805032A、CN102823490A、CN102577953A、CN103125380A、CN102318560A、CN102860255A、CN102115727A。

较有特色的抑制褐化专利有：公布号CN103202233A《一种蝴蝶兰防褐化组培方法及防褐化培养基》在初代培养和增殖分化培养中将金盏花、柠檬、西红柿、迷迭香等提取液添加到相应的培养基中。CN103004602A《一种抑制山核桃外植体褐化的方法》儿茶素应用到培养基中。CN102870677A《一种促进互叶白千层丛生芽增殖及防止继代培养褐化的方法》培养基应用稀土化合物包括镧、铈、钕、镨、钐的硝酸盐和氧化物。CN101148653《抑制兰属植物组织培养褐变发生的方法》将外植体消毒后用赤霉素和／生长素浸泡，诱导不定芽在培养基加入6-BA，4-PU或TDZ.CN1737142《一种防止植物愈伤组织褐化现象产生的方法》在继代培养基添加多胺(精胺或亚精胺)，黑暗培养，培养瓶定期气体交换。CN1742564《一种牡丹组培苗增殖及褐化和玻璃化防止方法》采用的MS培养基取1／2-1／3微量元素，Ca²⁺加倍，CaCl₂与CaNO₃的摩尔比为1∶1。

目前植物组培外置体消毒首选氯化汞或次氯酸钠(钙)，对外植体有较大毒副作用，对人体有毒，危害环境，外植体消毒杀菌和抗褐化是分步进行的，效率低下。急需研发杀菌广谱高效，对植物药害小，对人体安全，环境友好，操作方便，价格便宜的新型消毒剂。

发明内容

本发明解决的是目前植物组织培养外植体消毒剂对人体有毒，严重污染环境及对植物培养物伤害大的技术问题。由于还原性物质对植物细胞作用温和，损伤小，还能抑制外植体切口酚类物质被氧化成有毒物质(醌类)，从而保护植物细胞，所以采用还原性高效杀菌剂具有对组培外植体消毒的同时抑制褐化，提高成活率的双重功效。本发明公布了抗褐化消毒剂的成分、配制方法和使用方法。