[发明专利]高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗的制备方法及其产品

说明书

技术领域

本发明涉及猪繁殖与呼吸综合征活疫苗的生产方法，尤其涉及一种利用WAVE波浪生物反应器生产预防或治疗高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗的方法，属于高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗的生产领域。

背景技术

猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）以妊娠母猪的繁殖障碍(流产、死胎、木乃伊胎)及各种年龄猪特别是仔猪的呼吸道疾病为特征，现已经成为规模化猪场的主要疫病之一。中国将其列为二类传染病。猪繁殖与呼吸综合征是一种高度接触性传染病，呈地方流行性。猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）只感染猪，各种品种、不同年龄和用途的猪均可感染，但以妊娠母猪和1月龄以内的仔猪最易感。患病猪和带毒猪是本病的重要传染源。主要传播途径是接触感染、空气传播和精液传播，也可通过胎盘垂直传播。感染猪的流动也是本病的重要传播方式。持续性感染是PRRS流行病学的重要特征，PRRSV可在感染猪体内存在很长时间。猪繁殖与呼吸综合征尚无有效治疗药物，疫苗免疫接种是预防和控制猪繁殖与呼吸综合征病的根本措施。

目前，猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗的生产主要是转瓶细胞培养的传统培养方式，进而增殖PRRSV。但转瓶培养细胞增殖较为缓慢而且生产过程中对细胞和病毒的培养条件，如pH、溶氧、糖耗等难以监控和适时补给，无法提供最佳的培养条件，造成该方法自动化程度低，劳动强度大，并因为转瓶细胞培养环境的不可控性，导致存在生产的产品质量稳定性不够、批间差较大、产量低等问题。利用生物反应器替代转瓶生产疫苗株则克服了上述所述不足，成为最具有前途的猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗生产技术之一。

WAVE波浪生物反应器是采用抛弃型生产技术进行细胞培养的一种新型反应器。其工作方式是，细胞接种于可抛弃的细胞培养袋内，接种细胞的培养袋固定在托盘上以一定的方式摇动，精密控制的摇动保证了培养体系的有效混合和传氧效率。

采用WAVE波浪生物反应器生产猪繁殖与呼吸综合征活疫苗时，所加入微载体的含量、细胞接种密度、细胞培养袋的摇动参数等生产条件对于猪繁殖与呼吸综合征活疫苗的生产效率以及免疫保护效力的高低等有非常显著的影响，在生产实践中需要对这些条件进行优化才能有效提高猪繁殖与呼吸综合征活疫苗的生产效率及其免疫保护效力。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用WAVE波浪生物反应器生产高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗的方法，该方法对微载体的含量、细胞接种密度、细胞培养条件等参数进行了优化，有效提升了猪繁殖与呼吸综合征活疫苗的生产效率以及免疫保护效力。

本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：

一种高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗的生产方法，包括：（1）细胞的培养：将细胞接种到细胞培养袋中的微载体上，加入细胞培养基，摇动细胞培养袋培养细胞；（2）病毒液的增殖：沉降微载体，洗涤培养的细胞，接种猪繁殖与呼吸综合征病毒毒种，加入病毒增殖培养基培养细胞，收获病毒液；（3）将病毒液与保护剂混合均匀，得到高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗；其中，将Marc-145细胞按照3×10⁵个/ml的接种密度接种到细胞培养袋中的微载体上。

本发明采用WAVE波浪生物反应器，主要优点有1）免除生物反应器清洗、消毒及其相关认证。2）封闭培养系统，无需固定的管道，简化细胞培养厂房，缩短反应器安装和生产产品转换时间。3）细胞培养袋Cellbag放在特殊设计的摇动平台上，平台的摇动在培养液中产生波浪提供培养物混合和氧气传递，产生一个适于细胞生长的完美环境。

采用WAVE波浪生物反应器培养Marc-145细胞时，细胞接种密度、微载体含量以及摇动培养条件对于Marc-145细胞在微载体上的吸附以及细胞生长等有非常显著的影响，为了筛选到最适宜的培养参数以最大限度的促进Marc-145细胞生长，本发明采用正交试验，选择对Marc-145细胞生长影响较大的细胞接种密度、微载体含量和摇动条件作为考察对象，经过实验摸索确定相关水平，并运用极差分析法进行数据处理，对工艺参数进行了优化考察，观察不同的培养条件对于细胞的生长所带来的影响。

其中，当细胞接种密度为3×10⁵个/ml、微载体含量为2g/L、摇动培养条件为7°、14rpm时，Marc-145细胞含量远远高于其它的参数，Marc-145细胞的含量达到2.79×10⁷个/毫升。