[发明专利]使用具有白细胞介素-12受体的细胞检测重组人白细胞介素-12体外活性的方法及应用

说明书

技术领域

本发明涉及重组人白细胞介素-12活性的检测技术，具体涉及一种使用具有白细胞介素-12受体的细胞检测重组人白细胞介素-12体外活性的方法。

背景技术

具有白细胞介素-12受体的细胞，能够受到白细胞介素-12的诱导，诱发细胞内的信号传导。NK-92是一株白细胞介素-2依赖型自然杀伤细胞株。实验证明，NK92细胞在白细胞介素-12的诱导下，调节细胞表面受体的表达量，增强与肿瘤细胞表面配体的结合，抑制和杀死肿瘤细胞。或者是NK92细胞通过分泌免疫因子（例如：干扰素）和其他细胞因子直接抑制肿瘤细胞生长。白细胞介素-12（IL-12）是一种异源二聚体分子，是由单核/巨噬细胞及B淋巴细胞产生的一种细胞因子。

重组人白细胞介素-12（rhIL-12）是通过基因工程技术，采用真核细胞表达的编码人的白细胞介素-12。实验证明，重组人白细胞介素-12能够通过刺激NK细胞和T细胞增殖活化从而介导主动和被动免疫保护反应，是连接天然免疫和获得性免疫的功能性桥梁，具有多种重要生物学功能和药理作用，可应用于抗肿瘤、抗感染、抗哮喘、抗结核等多个领域。近年的研究发现，小剂量的rhIL-12可以刺激骨髓造血、保护造血微环境从而全面恢复受损血像，起到辐射和肿瘤放化疗防护的作用，作为抗辐射药试剂，重组人IL-12具有巨大的药物开发价值和临床应用价值。目前的研究中，rhIL-12的体外活性检测通常采用人的外周血，测定计数血细胞集落的方法，或者测定人外周血在rhIL-12刺激下产生γ干扰素的方法。用人外周血测定rhIL-12的活性，一方面细胞来源不能得到保证，同时由于人的个体差异，不能保证每次采集的血细胞性能相同，导致实验的准确性、精确性和重复性差。

发明内容

本发明所要解决的第一个技术问题是：针对现有技术中由于人的个体差异，导致rhIL-12的体外活性检测结果的准确性、精确性和重复性差的问题，提供一种检测准确性和精确性高、重复性好的使用具有白细胞介素-12受体的稳定细胞检测重组人白细胞介素-12体外活性的方法。

本发明所要解决的第二个技术问题是：提供使用具有白细胞介素-12受体的细胞在检测重组人白细胞介素-12体外活性中的应用。

为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：

使用具有白细胞介素-12受体的细胞检测重组人白细胞介素-12体外活性的方法，包括以下步骤：

（1）从液氮罐取出一支冻存的具有白细胞介素-12受体的细胞，将细胞快速融化复苏，在培养基中静置培养传代至对数生长期。

（2）使用不同浓度的重组人白细胞介素-12标准品与步骤（1）得到的具有白细胞介素-12受体的细胞在培养基中共培养，诱导具有白细胞介素-12受体的细胞产生γ干扰素，以产生的γ干扰素的量为纵坐标，以重组人白细胞介素-12标准品的浓度为横坐标，得到S型标准曲线，从S型标准曲线中得到γ干扰素的量的最大值的一半时所对应的重组人白细胞介素-12标准品的浓度值，该浓度值记作为ED50s。

（3）使用不同浓度的待测重组人白细胞介素-12蛋白质与步骤（1）得到的具有白细胞介素-12受体的细胞在培养基中共培养，诱导具有白细胞介素-12受体的细胞产生γ干扰素，以产生的γ干扰素的量为纵坐标，以待测重组人白细胞介素-12蛋白质的浓度为横坐标，得到S型标准曲线，从S型标准曲线中得到γ干扰素的量的最大值的一半时所对应的待测重组人白细胞介素-12蛋白质的浓度值，该浓度值记作为ED50r。

（4）根据公式Pr=Ps×ED50s/ED50r，计算得到所述待测重组人白细胞介素-12蛋白质的体外活性Pr,其中Ps为重组人白细胞介素-12标准品的活性值。

所述步骤（2）和步骤（3）同时操作，并使用同源的具有白细胞介素-12受体的细胞，使用相同的培养条件和相同的操作步骤。

优选的，步骤（1）中，从液氮罐取出一支冻存的具有白细胞介素-12受体的细胞，将细胞快速融化复苏，置换掉冻存液，按照具有白细胞介素-12受体的细胞在培养基中的密度为2～3×10⁵进行重悬后，静置活化培养，将对数生长期的具有白细胞介素-12受体的细胞使用培养基重悬细胞，将活化后的具有白细胞介素-12受体的细胞转移到检测孔板中。

所述具有白细胞介素-12受体的细胞，具有表达人白细胞介素-12的受体β1和β2（IL-12Rβ1和β2）的能力，能够与人白细胞介素-12结合，并且诱导产生γ干扰素（INF-γ）。