[发明专利]用于生物合成生产的重组宿主细胞

说明书

本发明涉及一种细胞，该细胞包括编码一种多酶复合体的异源多核苷酸，该多酶复合体参与苯丙烷代谢途径和香草素或其羟基苯甲醛前体的生物合成，该多酶复合体包括用于香豆酸和巴豆酸酶的生物合成的酶。

发明领域

本发明涉及一种细胞，该细胞包括编码一种多酶复合体的异源多核苷酸，该多酶复合体参与苯丙烷代谢途径，并且涉及其在香草素或其羟基苯甲醛前体的生物合成中用途。

背景技术

香草醛是在食品、饮料、香料和药物中的最重要的芳香风味化合物之一。从兰科扁叶香果兰(Vanilla planifolia)豆中提取的天然香草醛是相当昂贵的。香草豆的生产是一个漫长的过程，其高度依赖于适合的土壤和气候条件。在4-5年的栽培后豆子出现并且该芳香在需要6个月的所谓的“固化”的长时间过程后在水果中发育出。消费者对天然香草醛的需求高度超过对通过植物源提取的香草醛的量。少于5％的全世界香草醛生产来自天然香草。由于天然香草提取物的稀缺和费用，长期以来已经存在合成制备其主要成分的关注。香草醛(4-羟基-3-甲氧基苯甲-醛)是香草风味的主要感官成分。

因为对香草醛的需求高于可从兰科扁叶香果兰豆中提取的，所以其余部分通过可替代的方式产生。化学合成是香草醛的最重要来源。香草醛首先是从发现于丁子香的油中的丁香酚合成的并且后来从包含亚硫酸盐液体的木质素中合成的，该木质素是一种在纸张生产中木浆加工的副产物。尽管一些香草醛仍然由木质素废弃物制备，现今大部分合成的香草醛以一个两步法从石油化学的前体：愈创木酚和乙醛酸合成。香草醛也可通过姜黄素、丁香酚或胡椒碱的分子断裂化学地产生。

天然和合成的香草醛的价格之间的大差异、增加的消费者导向的对“天然的”和“健康的”香料需求、以及对“天然的”市场要求的服务已经导致对香料工业日益增长的关注以从其他天然来源通过生物转化^1,2,3,4,5产生天然香草醛。微生物细胞和其他的酶在精细化学品的合成中作为生物催化剂的使用已经在绿色化学和白色生物技术中备受关注。由于欧洲社会法律，此类生物转化的产物被认为是天然的(包含在术语“天然产物”下通过活细胞或它们的酶从生物源产生的产物。

用于生产的可替代的基于生物技术的方法是基于木质素、二苯乙烯型酚、异丁子香酚、丁香酚、阿魏酸或芳香族氨基酸的生物转化，并且基于从头生物合成、应用真菌、细菌、植物细胞或基因工程微生物。虽然经由异丁子香酚的转化的香草醛生产已经在各种微生物中广泛被报道，包括黑曲霉⁶；克雷白氏菌属、肠杆菌属和沙雷氏菌属的菌株⁷；玫瑰色红球菌⁸；枯草芽孢杆菌B2⁹；梭形芽孢杆菌¹⁰；枯草芽孢杆菌HS8¹¹；硝基还原假单胞菌¹²；恶臭假单胞菌¹³；绿针假单胞菌¹⁴；短小芽孢杆菌¹⁵；以及伊文思诺卡氏菌(Nocardia iowensis)¹⁶。最近描述了使用代谢工程化酵母菌株从葡萄糖从头合成¹⁷。

酿酒酵母是一种有用的细胞，工厂依赖其生产高价值工业生物技术产品。它非常适合于生物精炼工艺，归因于其细胞-再利用发酵和其对抗各种压力(诸如低pH、高温和各种抑制剂¹⁸)的非凡耐受性的能力。此外，酿酒酵母是一种被极好地表征的促进代谢工程¹⁹的模式生物，²⁰归因于全基因组序列的可得性和代谢途径的详细表征²¹。

US 6372461 B1描述了香草醛通过需要五种由重组微生物提供的酶的微生物-催化转化步骤从碳源的合成以及酶-催化的还原步骤以通过芳基-醛脱氢酶还原香草酸。

EP 2388333 A2描述了一种能够生产香草醛的微生物细胞，包括至少三种异源酶活性，即3-脱氢莽草酸脱水酶、芳香族羧酸还原酶和3O-甲基转移酶活性。

WO 2011124693 A1描述了通过部分同源的体内重组产生基因嵌合体的方法，由此可以构建在自然界中不存在的代谢途径。