[发明专利]FAD2性能基因座及相应的能够诱导靶向断裂的靶位点特异性结合蛋白

权利要求书

1.一种修饰细胞的基因组的方法，该方法包括：

以位点特异性方式剪切细胞中的FAD2基因中的靶位点，从而在该FAD2基因中产生断裂；

其中该FAD2基因在剪切之后被修饰。

2.权利要求1的方法，其中该方法进一步包括向该断裂中整合感兴趣的核酸序列。

3.根据权利要求1或权利要求2的方法，其中所述FAD2基因是FAD2A,FAD2A’,FAD2C和/或FAD2C’基因。

4.根据权利要求1-3中任一项的方法，其中位点特异性方式的剪切包括向细胞内引入融合蛋白或编码融合蛋白的多核苷酸，所述融合蛋白包含DNA结合结构域以及剪切结构域或剪切半结构域，其中该融合蛋白与所述靶位点特异性结合，并在靶位点处或其附近进行剪切从而产生断裂。

5.根据权利要求4的方法，其中该DNA结合结构域选自下组：大范围核酸酶DNA结合结构域，亮氨酸拉链DNA结合结构域，转录激活因子样(TAL)DNA结合结构域，RNA指导的CRISPR-Cas9，重组酶，锌指蛋白DNA结合结构域，和前述者的任何嵌合组合。

6.根据权利要求4或权利要求5的方法，其中该剪切结构域或剪切半结构域选自下组：来自IIS型限制性核酸内切酶的剪切半结构域，来自FokI核酸内切酶的剪切半结构域，来自StsI核酸内切酶的剪切半结构域，和归巢核酸内切酶。

7.根据权利要求4-6中任一项的方法，其中该融合蛋白是锌指核酸酶。

8.根据权利要求7的方法，其中该锌指核酸酶包括3-6个锌指结构域，每个锌指结构域包括识别螺旋区，其中该锌指蛋白包括在表3的单一行中排序并显示的识别螺旋区。

9.根据权利要求1-8中任一项的方法，其中位点特异性方式的剪切是对FAD2A,FAD2A’,FAD2C和/或FAD2C’的一些拷贝但非所有拷贝特异性的。

10.根据权利要求1-9中任一项的方法，其中该靶位点选自下组：SEQ IDNO:22-26,和SEQ ID NO:28-33和SEQ ID NO:35-38。

11.根据权利要求1-10中任一项的方法，其中该细胞是植物、真菌、细菌或藻类细胞。

12.根据权利要求11的方法，其中该植物细胞是单子叶植物细胞或双子叶植物细胞。

13.根据权利要求12的方法，其中该植物细胞选自下组：芸苔属(Brassica sp.)，欧洲油菜(Brassica napus)；芜菁(Brassica rapa)；芥菜(Brassica juencea)；甘蓝(Brassica oleracea)；黑芥(Brassica nigra)；玉米属(Zea sp.)；玉米(Zea mays)；大豆属(Glycine sp.)；大豆(Glycine max)；小麦属(Triticum sp)；普通小麦(Triticum aestivum)；稻属(Oryza sp.)；水稻(Oryza sativa)；Triticae sp.；Triticae triticum；向日葵属(Heliantheae sp.)；向日葵(Heliantheae helianthus)；棉属(Gossypium sp.)；陆地棉(Gossypium hirsutum)；和大麦(Hordeum vulgar)。

14.根据权利要求2-13中任一项的方法，其中感兴趣的核酸序列选自下组：包含DNA结合结构域结合靶位点的序列，一个或多个杀虫剂抗性基因，一个或多个除草剂抗性基因，一个或多个氮使用效率基因，一个或多个水使用效率基因，一个或多个营养品质基因，一个或多个DNA结合基因，一个或多个可选择标志物基因，及其组合。

15.一种细胞、种子或植物，其包括根据权利要求1-14中任一项的方法修饰的细胞。

16.根据权利要求15的细胞、种子或植物，其中该细胞、种子或植物是转基因的细胞、种子或植物，其包含整合到FAD2A,FAD2A’,FAD2C和/或FAD2C’基因的一个或多个拷贝中的感兴趣核苷酸序列。

17.权利要求16的细胞、种子或植物，其中所述核苷酸序列对所述细胞而言是异源或同源的。