[发明专利]一种β-葡萄糖苷酶交联聚集体催化合成红景天苷的工艺

说明书

技术领域

本发明属于酶催化合成红景天苷领域，尤其是一种β-葡萄糖苷酶交联聚集体（简称：β-葡萄糖苷酶CLEAs）催化合成红景天苷的工艺。

背景技术

红景天苷是具有特殊生理功能的化合物，它在抗细胞缺氧、抗肿瘤、增强机体免疫力等方面均有良好效果。由于生物合成红景天苷具有选择性高、反应条件温和、产物纯度较高、产品便于分离纯化等优点，因此受到普遍关注。

鉴于酶催化合成红景天苷的反应时间比植物组织培养和细胞培养时间都要短很多，并且，反应过程无需昂贵的糖苷供体和催化剂，避免了化学合成繁琐的反应步骤，另外，反应完成后可以方便的从反应液中提取目标产物红景天苷，未反应的底物对羟基苯乙醇可再次循环使用，降低生产成本，因此，酶催化合成红景天苷为红景天苷批量生产具有非常大的经济意义和现实意义。

由于红景天苷在糖苷酶的存在下极易被水解，而生物合成红景天苷过程中所需的酶又需要水环境来保持其活性，即保持较高的红景天苷合成效率，因此，如何实现保持酶活性与抑制红景天苷水解的平衡点，成为了一大难题。陈磊在其硕士学位论文“西梅籽β-葡萄糖苷酶的分离纯化、性质及固定化研究”一文中提到了关于β-葡萄糖苷酶交联聚集体在合成红景天苷中的应用，其结论是：以β-葡萄糖苷酶交联聚集体为催化剂催化合成红景天苷的反应中，产物红景天苷的浓度大约为0.76 g/L，仅比采用粗酶粉催化合成红景天苷的产物红景天苷浓度高0.1 g/L。王梦亮等人于2009年发表了一篇“固定化β-葡萄糖苷酶催化合成红景天苷的研究”的文章，在 1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐（C₄MIm·PF₆）离子液体/1,4-二氧六环作为反应介质，C₄MIm·PF₆ /1,4-二氧六环为99%（v/v），经过条件优化后，红景天苷产物浓度可达18.57 g/L，此为现阶段国内外生物合成红景天苷领域红景天苷浓度可达到的最高值。但是，产物红景天苷的浓度依然较低，无法满足工业化生产对经济利益最大化的需求，并且，酶活回收率较低。

发明内容

本发明旨在提供一种能够大幅提高产物红景天苷浓度的β-葡萄糖苷酶交联聚集体（简称：β-葡萄糖苷酶CLEAs）催化合成红景天苷的工艺，本发明反应过程无需昂贵的糖苷供体和催化剂，避免了化学合成繁琐的反应步骤，另外，反应完成后可以方便的从反应液中提取目标产物红景天苷，未反应的底物对羟基苯乙醇可再次循环使用，降低生产成本，同时解决了由于离子液体价格昂贵，离子液体的加入量在工艺中仍然很大，使得生产红景天苷的成本偏高等问题，因此，酶催化合成红景天苷为红景天苷批量生产具有非常大的经济意义和现实意义。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种β-葡萄糖苷酶交联聚集体催化合成红景天苷的工艺，包括β-葡萄糖苷酶交联聚集体的制备和红景天苷的合成两个阶段；

β-葡萄糖苷酶交联聚集体制备阶段，包括以下步骤：

（1）将沉降剂加入β-葡萄糖苷酶溶液中，振荡；

（2）再加入戊二醛；

（3）向混合液中加入硼氢化钠，振荡后，300~500rpm离心5~10min，收集沉淀，即为β-葡萄糖苷酶交联聚集体；

红景天苷的合成阶段，包括以下步骤：

（4）将β-D-葡萄糖和对羟基苯乙醇溶解于含β-葡萄糖苷酶交联聚集体的pH 为5.5~6.5的缓冲溶液中，再加入1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐、仿水溶剂和1,4-二氧六环，形成1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐/仿水溶剂/1,4-二氧六环/缓冲溶液反应体系，仿水溶剂为乙酸乙酯；（5）密封，保持温度为48~52℃，转速为245~255 rpm，反应5~9d，收集反应液；

其中，步骤（4）的1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐/仿水溶剂/1,4-二氧六环/缓冲溶液反应体系中，β-D-葡萄糖与对羟基苯乙醇的摩尔比为1:1~1:3，1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐的单位酶活为1.3~1.6U/ml ， 1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐与乙酸乙酯的体积和与1,4-二氧六环的体积比为2:3~3:2，缓冲溶液的体积分数为12~18%。